Микроманипуляции методы, позволяя анализ морфогенетических динамики и оборот цитоскелета регуляторов

Общая цель использования комбинации методов микроманипуляции и световой микроскопии, таких как FRAP и фотоактивация, заключается в мониторинге пространственно-временной динамики белков, участвующих в регуляции и миграции цитоскелета в различных условиях или в зависимости от сигнального пути. Обсуждаемые здесь методы микроманипуляций полезны для прямой доставки любого типа молекул в клетки, а также для индуцированных светом манипуляций с активностью белка в определенных субклеточных местах. Таким образом, основное преимущество представленных здесь методик заключается в том, что они позволяют определить мгновенные эффекты, которые белки оказывают на клетки, а также отслеживать их подвижность по всей длине клетки.

Чтобы начать эту процедуру, пассаж ранее выращенные клетки B16-F1 в соотношении один к пяти в трехсантиметровую пластиковую посуду. Аспирируйте среду для культивирования клеток. Промойте клетки PBS, аспирируйте PBS и добавьте трипсин ЭДТА, чтобы отделить клетки.

Добавьте к трипсинизированным клеткам среду для культивирования клеток. Повторно суспензируйте и перенесите ячейки в соколиные пробирки, после чего центрифугируйте при 1000 об/мин в течение трех-пяти минут. После помещения клеток B16-F1 в трехсантиметровую чашку и предоставления им возможности для распространения в течение не менее шести часов, трансфицируйте клетки B16-F1, добавив смесь 500 нанограммов ДНК-конструкции и одного микролитра реагента для трансфекции в раствор, содержащий 150 миллимоляров хлорида натрия.

Для клеток В16-F1 обмазывают 15-миллиметровой крышкой слипов со 150 микролитрами раствора ламинина и выдерживают в течение одного часа при комнатной температуре. Для клеток NIH 3T3 обмазать покровные стекла раствором фибронектина и инкубировать в течение часа при комнатной температуре. После инкубации промойте инкубированный ламинин и фибронектин покровными листками с PBS, затем аспирируйте PBS.

Засейте два миллилитра фибробластов NIH 3T3 в соотношении один к 20 из сливающейся чашки на покрытые фибронектином покровные листы. Пипетируйте два миллилитра трансфицированных клеток B16-F1 в соотношении один к 30 из сливающейся чашки на покрытые ламинином покровные листы. После этого позволяют клеткам распределиться по покровным стеклам, покрытым ламинином и фибронектином, в течение ночи в инкубаторе для тканевых культур при температуре 37 градусов Цельсия перед микроскопией.

Поместите защитное стекло ячейками вверх на теплопроводящую алюминиевую камеру для визуализации RC-26. Затем поместите пластиковый герметик на верхнюю часть покровного стекла, чтобы сделать надежное уплотнение между крышкой и камерой, закрепите, прикрутив пластиковый герметик к скользящим зажимам камеры, чтобы избежать утечки среды. Теперь пипетка под давлением 37 градусов Цельсия предварительно подогрела микроскопическую среду в центральную область.

Вставьте тепловой извещатель в предназначенный для этого слот камеры и подключите электроды камеры к автоматическому регулятору температуры TC-324B, поддерживающему постоянную температуру 37 градусов Цельсия. Центрифугируйте ранее размороженный белковый раствор при температуре 10 000 г в течение не менее 30 минут, чтобы удалить белковые агрегаты, которые могут привести к закупорке иглой, если они присутствуют в капилляре микроинъекции. С помощью гибкого наконечника пипетки загрузите иглу для микроинъекций одним микролитром белкового раствора с тыльной стороны.

Если на кончике иглы присутствуют пузырьки воздуха, осторожно постучите по основанию иглы, чтобы удалить их. Затем тщательно отрегулируйте иглодержатель на микроманипуляционном устройстве. После вкручивания иглы для микроинъекций в иглодержатель надавите на иглу с помощью устройства для микроинъекций, прежде чем переместить кончик иглы в среду для культивирования клеток.

Затем расположите иглу в поле зрения с помощью объектива с малым увеличением, затем найдите интересующую вас ячейку и постепенно опускайте иглу над ней. При микроинъекции осторожно коснитесь плазматической мембраны клетки, чего может быть достаточно для проникновения в клетку или предотвращения временного разрыва мембраны, очень легким постукиванием по установке микроскопа. Остановите процесс инъекции, как только станет виден поток в клетку, переместив кончик иглы вверх в среду.

Перед запуском лазера переключитесь на канал GFP и инициируйте цейтраферную съемку изображения. После этого вручную нарисуйте область, подлежащую фотообесцвечиванию, на канале GFP во время просмотра дисплея. Инициируйте фотообесцвечивание с помощью ручного запуска 405-нанометрового лазера по крайней мере через три-четыре кадра после начала получения изображения.

Установите в программном обеспечении для получения изображений GFP 488 нанометров на 500 миллисекунд экспозиции и 1500 миллисекунд временного интервала. Затем отрегулируйте настройки программного обеспечения для захвата двухканальных или трехканальных интервальных видеороликов, отметив квадрат серии длин волн и выбрав нужное количество каналов в меню захвата длины волны. Перед запуском лазера инициируйте цейтраферную съемку изображения и вручную нарисуйте область, подлежащую фотоактивации, на фазово-контрастном канале во время просмотра дисплея.

После этого инициируйте фотоактивацию ручным запуском 405-нанометрового лазера, по крайней мере, через три-четыре кадра после начала получения изображения. Для анализа результатов FRAP откройте видеоролики с интервальной съемкой, полученные из VisiView, в программном обеспечении MetaMorph. Получение значений интенсивности фотообесцвеченных областей для каждой временной точки восстановления флуоресценции путем ручного рисования соответствующих областей с помощью MetaMorph.

Нарисуйте на кончике пластинчатого подиума фигуру, которая покрывает всю или часть фотообесцвеченной области, и при необходимости вручную отрегулируйте ее положение на последующих кадрах, чтобы отслеживать изменения интенсивности ламеллиподиального сечения соответствующей области с течением времени во время смещения продвигающегося кончика. Для коррекции фона и получения фотообесцвечивания анализируют участки снаружи и внутри клеток соответственно. После того, как интересующая область выбрана, извлеките значения ее интенсивности на MetaMorph с помощью меню Измерить измерения области.

Убедитесь, что в меню настройки выбраны параметры затраченного времени и средней интенсивности. Нажмите открыть журнал и выберите динамический обмен данными. Затем нажмите OK, чтобы открыть таблицу Excel, и нажмите кнопку «Открыть журнал» еще раз, чтобы вставить значения MetaMorph в Excel.

Используйте значения интенсивности, полученные из MetaMorph, для расчета кривых восстановления флуоресценции FRAP, вставив значения интенсивности в таблицу Excel, содержащую соответствующие формулы. Флуоресцентное восстановление фотообесцвеченной области нормализуется по фону и внутренним областям. Для вычисления полувремени восстановления флуоресценции вставьте значения кривых восстановления флуоресценции с соответствующими временами в SigmaPlot, затем выполните аппроксимацию кривой с помощью инструмента мастера динамической аппроксимации экспоненциального подъема до максимума, выбрав моно- или биэкспоненциальную функцию в зависимости от наилучшей аппроксимации кривой.

Параметры, полученные при решении выбранной функции, могут быть вставлены в таблицу Excel, содержащую соответствующую формулу, позволяющую рассчитать соответствующее время восстановления в секундах. Для измерения диффузии фотоактивируемого актина при активации, а также его накопления в определенной области, такой как ламеллиподий, используйте MetaMorph для определения интенсивностей с течением времени в соответствующих областях, а также за пределами клетки, чтобы определить фоновую флуоресценцию для нормализации. Для изучения точной скорости вытеснения фотоактивируемого актина из области активации или скорости его встраивания в ламеллиподиум сгенерируйте кривые флуоресценции на основе данных, ранее полученных с помощью MetaMorph.

Вставьте значения интенсивности для области фона, используемой для нормализации, фотоактивированной цитозольной области или исследуемой пластиноногой области в таблицу Excel, содержащую соответствующие формулы. Здесь представлены изображения с контрастом лица клетки фибробласта NIH 3T3 до и после микроинъекции малой ГТФазы Rac1. Примерно через 12 минут после микроинъекции клетка меняет свою морфологию, что свидетельствует об успешной инъекции.

Здесь показана переработка отбеленного EGFP VASP неотбеленными молекулами на ламеллиподиумном наконечнике. В этом конкретном примере восстановительная флуоресценция выходит на плато примерно на 80% от флуоресценции до обесцвечивания. При фотоактивации фотоактивированный GFP актин быстро диффундирует из цитозольной области.

Фракция фотоактивированных мономеров актина перемещается вперед, создавая быстрый всплеск флуоресценции в ламелоподиях. Включение флуоресценции восхитительно ниже в ламеллиподиях, удаленных от фотоактивированной области, поскольку фракция фотоактивированных мономеров актина разбавляется неактивированными мономерами во время их путешествия через цитозоль. По мере того, как фотоактивированный GFP актин диффундирует из фотоактивированной области с течением времени, он непрерывно заменяется нефотоактивированным нефлуоресцентным актином.

Как следствие, наблюдается постепенное снижение интенсивности флуоресценции этой области. Со временем ламеллиподии, расположенные близко к цитозольной области активации, быстро поглощают флуоресцентный актин. Последующее снижение флуоресценции происходит просто из-за деполимеризации актина и диффузии мономера от ламелиподия.

Таким образом, когда эксперименты проводятся на одной системе микроскопии, комбинация микроинъекций и методов FRAP или фотоактивации может быть реалистично выполнена в течение нескольких минут, в зависимости от природы исследуемых белков. Всегда помните о том, что вы должны быть счастливы до, во время и после микроманипуляций или после воздействия лазерного света. Для FRAP и фотоактивации особенно важно, чтобы выбранная область сохраняла свою структурную целостность на протяжении всего фильма.

Процедура микроинъекций может быть дополнена местным применением препаратов, проницаемых для плазматической мембраны, или ингибиторов цитоскелета для устранения немедленных последствий назначенного лечения на субклеточном уровне. Методы микроманипуляций проложили путь к изучению диффузионных свойств и субклеточной динамики компонентов и комплексов цитоскелета, а также к пониманию вторичных путей, регулирующих клеточный морфогенез. После просмотра этого видео у вас должно быть хорошее понимание того, как отслеживать и контролировать пространственно-временную динамику цитозольных белков, белков, включенных в действие внутри цитоскелета или находящихся в различных субклеточных органеллах, в конечном итоге раскрывая кинетику клеточной регуляции.