Сбор данных о крио-ЭМ с одной частицей с наклоном ступени с помощью Leginon
1 июля 2022 г.
В настоящем протоколе описана обобщенная и простая в реализации схема наклонного сбора данных об одночастичных частицах в крио-ЭМ-экспериментах. Такая процедура особенно полезна для получения высококачественной ЭМ-карты для образцов, страдающих преимущественным смещением ориентации из-за прилипания к границе раздела воздух-вода.
Наклон ступени образца обеспечивает простой и обобщаемый способ увеличения распределения ориентации частиц при сборе одночастичных крио-ЭМ-данных. Равномерное распределение частиц, полученное за счет наклона ступени образца, позволяет улучшить общее качество карты и интерпретируемость. Начните с выравнивания микроскопа, чтобы обеспечить параллельное освещение образца и свести к минимуму аберрации комы.
Чтобы определить квадраты, пригодные для сбора данных, запишите атлас сетки без наклона сцены или с наклоном сцены, который дает общее представление об общем качестве сетки и первоначальное указание подходящих областей для сбора данных. Осмотрите квадраты вручную при увеличении, используемом в узле сбора квадратов. Найдите квадраты, в которых фольга не повреждена, не выглядит обезвоженной и имеет идеальную толщину льда, и переместите стадию образца в интересующий квадрат.
Определите эуцентрическую высоту для положения столика с помощью альфа-воблера при наклоне столика около 15 градусов и отрегулируйте высоту Z, чтобы довести предметный столик до эуцентрической высоты, используя панель клавиатуры микроскопа. Убедитесь, что сдвиг изображения минимален во время процедуры альфа-колебания. Чтобы найти более точную высоту Z, оцените ее в узле фокусера по увеличению, используемому в квадратном узле захвата.
Отрегулируйте настройки узла фокусера и включите или отключите параметр точной фокусировки Z во время первоначальной очереди квадратов. Затем нажмите «Имитировать». Наклоните столик образца на желаемый угол наклона для сбора данных на истинной эуцентрической высоте и при необходимости отцентрируйте столик.
Нажмите кнопку Имитировать в квадратном узле сбора данных, чтобы начать постановку в очередь целевых объектов для экспозиции всего узла сбора данных. Затем выберите Z-фокусную цель и области с отверстиями, подходящими для экспозиции с большим увеличением, и отправьте цели в очередь на съемку. Верните стадию образца в ненаклоненное состояние, а затем перейдите к следующему квадрату.
Повторяйте эти шаги до тех пор, пока не будет поставлено в очередь достаточное количество целых экспозиций. После того, как все квадраты поставлены в очередь, перейдите ко всему узлу таргетинга и нажмите «Отправить цели в очереди». Выберите «Разрешить» для проверки пользователем выбранных целей в настройках узла и вручную осмотрите цели, выбранные узлом сбора экспозиции с большим увеличением, чтобы проверить, может ли автоматический искатель электромагнитных отверстий точно определить подходящие области для получения изображения при наклоне столика образца.
Убедившись в точности таргетинга, снимите флажок Разрешить пользователю проверку выбранных целей для автоматического сбора данных. Здесь показаны репрезентативные изображения сетки при квадратном увеличении с различными углами наклона, собранные вблизи и вдали от эуцентрической высоты Z. Центр луча обозначен центром красных концентрических колец, а зеленая стрелка указывает на интересующий квадрат.
Для справки к интересующему квадрату примыкает сломанная сетка. Здесь показаны репрезентативные экспозиции отверстий и средние значения 2D-класса, собранные при углах наклона 0 градусов, 30 градусов и 60 градусов. Хотя концентрация белка остается неизменной при различных углах наклона, более высокий угол наклона делает изображенную область более переполненной с точки зрения концентрации частиц.
Средние значения 2D-классов, затронутые переполненностью, показаны в этом красном поле. Простота протокола позволяет любому стандартному пользователю микроскопа легко адаптировать наклонную стратегию сбора данных.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данном протоколе описан простой метод оптимизации сбора данных криоэлектронной томографии (крио-ЭМ) отдельных частиц путем наклона предметного столика. Этот подход особенно эффективен для повышения качества ЭМ-карт образцов, проявляющих склонность к преимущественной ориентации.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Криоэлектронная микроскопия (крио-ЭМ)
- Структурная биология
- Анализ отдельных частиц
Теоретические основы
- Криоэлектронная микроскопия (крио-ЭМ) отдельных частиц имеет решающее значение для определения структур биологических макромолекул.
- Образцы часто подвержены ориентационной предвзятости при прилипании к поверхностям.
- Улучшение ориентации частиц может повысить качество карты.
- Наклон предметного столика — это метод достижения более равномерного распределения частиц.
Цель исследования
- Представить протокол наклона предметного столика в процессе сбора данных крио-ЭМ.
- Уменьшить влияние преимущественной ориентации образцов.
- Повысить интерпретируемость ЭМ-карт.
Используемые методы
- Юстировка микроскопа для достижения оптимального освещения.
- Запись атласа сеток для оценки их качества.
- Осмотр квадратов для проверки соответствия идеальным условиям перед сбором данных.
- Ручной выбор квадратов на основе целостности фольги и толщины льда.
Основные результаты
- Наклон предметного столика расширяет распределение ориентаций частиц.
- Наблюдалось улучшение общего качества и интерпретируемости карты.
- Успешное определение подходящих квадратов для сбора данных.
- Снижение коматических аберраций за счет правильной юстировки.
Выводы
- Наклон предметного столика является эффективной стратегией в криоэлектронной микроскопии (cryo-EM).
- Данный метод позволяет значительно повысить качество карт электронной микроскопии.
- В будущем применение этого метода может способствовать дальнейшему совершенствованию методов сбора данных.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для отрасли
Криоэлектронная микроскопия (крио-ЭМ) одиночных частиц с наклоном объекта позволяет устранить критическое препятствие в структурной биологии — преимущественную ориентацию частиц, которая может ограничивать интерпретируемость и разрешение карты. Эта возможность повышает достоверность прогнозов при определении структуры макромолекул, что оказывает прямое влияние на этапы раннего поиска и валидации мишеней. Данный подход широко совместим со стандартными платформами ПЭМ, обеспечивая масштабируемый и воспроизводимый сбор данных в рамках портфелей биофармацевтических исследований и разработок.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Ранний поиск и валидация мишени
- Обеспечивает возможность всестороннего структурного анализа макромолекулярных мишеней за счет улучшения распределения ориентаций.
- Снижает механистическую неопределенность при валидации мишеней благодаря изотропному разрешению карты.
- Повышает прогностическую достоверность при разработке лекарств на основе структуры и приоритизации портфеля препаратов.
Скрининг и разработка анализа
- Подготавливает валидированные структурные наборы данных для последующего вычислительного анализа и скрининга.
- Обеспечивает воспроизводимую и количественную оценку распределения частиц в различных условиях.
- Позволяет надежно оценивать протоколы подготовки образцов и качество сеток.
Трансляционные и доклинические исследования
- Обеспечивает преемственность процесса от этапа открытия до доклинической валидации за счет предоставления высококачественных структурных данных.
- Поддерживает принятие решений о продвижении проектов с учетом рисков благодаря улучшенной интерпретируемости карт.
- Соответствует стратегиям трансляционных биомаркеров, когда структурные данные используются для оптимизации функциональных анализов.
Интеграция конвейеров и рабочих процессов
Сбор данных крио-ЭМ с наклоном предметного столика интегрируется в континуум от открытия до доклинических исследований, обеспечивая надежную структурную характеристику на ранних и промежуточных этапах разработки.
- Биология открытий: повышает эффективность проверки гипотез за счет снижения влияния ориентационного смещения и уточнения макромолекулярной архитектуры.
- Скрининг: обеспечивает воспроизводимые количественные распределения ориентаций для подготовки анализа и стандартизации методов.
- Аналитика: предоставляет высококачественные изотропные карты для сравнительного анализа и оптимизации условий.
- Трансляционные исследования: поддерживают преемственность доклинических этапов, обеспечивая надежность структурных данных для последующего применения.
- Корпоративное повторное использование: предлагает универсальный, совместимый с оборудованием рабочий процесс для многократного использования при работе с различными мишенями и проектами.
Операционное и организационное воздействие
- Научная ценность: повышает прогностическую уверенность и снижает структурную неоднозначность при валидации мишеней.
- Операционная ценность: стандартизирует сбор данных, повышает воспроизводимость и совместима с существующей инфраструктурой ПЭМ.
- Стратегическая ценность: улучшает качество принятия решений о продолжении или прекращении разработки (go/no-go) и снижает риски на поздних этапах за счет предоставления надежных структурных доказательств.
- Влияние на портфель: позволяет осуществлять приоритезацию с учетом рисков и продвигать структурно валидированные мишени.
Рекомендации по внедрению
- Требуется опыт в совмещении изображений крио-ЭМ и подготовке образцов.
- Необходим доступ к стандартным ПЭМ и программному обеспечению Leginon для автоматизированного сбора данных.
- Требуется межгрупповая стандартизация протоколов подготовки сеток и сбора данных.
- Метод применим для различных макромолекулярных образцов и типов сеток.
- Следует контролировать и минимизировать риск перекрытия объектов при больших углах наклона.
