Создание коленного сустава-на-чипе для моделирования заболеваний суставов и тестирования лекарств

Наша способность точно предсказывать, как люди реагируют на лекарства во время клинических испытаний, ограничена из-за отсутствия физиологически значимых доклинических моделей. Эта микрофизиологическая система может устранить это несоответствие. Эта система, полученная из клеток человека, точно имитирует всю природу остеоартрита в колене человека, что позволяет тестировать лекарства от остеоартрита, модифицирующие заболевание, до клинических испытаний, что потенциально экономит миллионы долларов.

Начните приготовление метакрилированного желатина, или GelMA, добавив 17 граммов желатина типа B в 500 миллилитров дистиллированной воды. Перемешивайте его в течение 30 минут на шейкере при температуре 37 градусов Цельсия и добавьте 13 миллилитров метакрилового ангидрида, прежде чем на ночь перемешивать на шейкере. На следующий день приготовьте около 60 миллилитров аликвот GelMA в диализные мешки.

Поместите все пакеты для диализа в дистиллированную воду с мешалкой на семь дней. Меняйте воду несколько раз в день и оставляйте пакеты при температуре четыре градуса Цельсия на ночь. На седьмой день налейте ГельМА в посуду и заморозьте его при минус 80 градусах Цельсия перед лиофилизацией.

Затем лиофилизируйте GelMA, поместив его в вакуумную камеру лиофилизатора. Перед извлечением из лиофилизатора обеспечьте полное высыхание. Затем растворите лиофилизированный GelMA в сбалансированном солевом растворе Хэнкса с концентрацией 15% и отрегулируйте рН до 7,4, используя небольшое количество гидроксида натрия.

В зависимости от приобретенного объема дополните раствор антибиотиком-антимикотическим препаратом и 0,15%-ным фенилфосфинатом лития, или LAP. Защищайте раствор GelMA от света и храните его при температуре минус 20 градусов Цельсия до дальнейшего использования. Двухпоточные биореакторные камеры, крышки и вкладыши с автоклавной печатью на 3D-принтере в автоклавных мешках при температуре 121 градус Цельсия в течение 20 минут с паром.

А затем, в течение 20 минут с сухим теплом. После стерилизации замочите камеры, крышки и вкладыши биореактора в 15 миллилитрах стерильного PBS на ночь внутри шкафа биобезопасности с последующей полной сушкой. Используя пипетку объемом 1000 микролитров, ресуспендируйте 20 раз по 10 до шестого количества мезенхимальных стволовых клеток, полученных из костного мозга человека, или МСК, на миллилитр клеток в 15% растворе GelMA.

Затем прижмите стерильную сухую силиконовую форму к чашке Петри, используя стерильные перчатки. Вставьте по одной вставке в каждое отверстие силиконовой формы щипцами стороной отверстия вкладыша вниз. После этого добавьте около 50 микролитров клеточной суспензии на вставку с помощью пипетки объемом 200 микролитров.

Сшите гель внутри вставки, подвергнув верхнюю часть воздействию ультрафиолетового фонарика с длиной волны 395 нанометров в течение 1,5 минут, а затем осветив другую сторону в течение 30 секунд. С помощью стерильных щипцов немедленно перенесите вкладыши в восемь миллилитров питательной среды в шестилуночную пластину для нетканевой культуры и дайте клеткам восстановиться в течение ночи. Чтобы инициировать дифференцировку жировой ткани, перенесите вкладыши на восемь миллилитров адипогенной среды и культивируйте их в течение 28 дней с ежедневной сменой среды.

Чтобы спроектировать остеохондральные установки, поместите вставки в двухпоточные камеры биореактора, закройте лунки и вливайте два потока отдельно со скоростью пять микролитров в минуту с 35 миллилитрами остеогенной среды и 35 миллилитрами хондрогенной среды. Поддерживайте клетки для дифференцировки в течение 28 дней, выполняя двухнедельную смену шприца с соответствующими типами сред. Чтобы получить фибробласты, дифференцируйте МСК в 2D-культуре в колбе для культуры тканевых клеток площадью 150 квадратных сантиметров, содержащей 20 миллилитров фиброгенной среды в течение 21 дня.

Поддерживайте еженедельную смену среды. Через 21 день используйте четыре миллилитра трипсина, чтобы отделить клетки. Инкапсулируйте 3D-гели во вкладыши.

Чтобы получить синовиально-подобную фиброзную ткань, или SFT, следуйте аналогичному протоколу. Подсоедините силиконовую трубку с внутренним диаметром 0.062 дюйма и внешним диаметром 0.125 дюйма к стержню биореактора minijoint на одном конце и разъемам замка приманки F 1/16 на другом конце. Затем автоклавируйте 3D-мини-биореакторы вместе с силиконовыми трубками и крышками.

Подготовьте и загрузите 35 миллилитров среды, которая будет использоваться для мини-совместной культуры, в резервуары для среды. Используйте прямые щипцы для переноса остеохондральных блоков из двухпоточного биореактора в правую лунку мини-совместного биореактора. Перенесите вставку жировой ткани и вставку из фиброзной ткани в левую и среднюю лунки соответственно, прежде чем накрыть все лунки стерилизованными крышками.

Подсоедините входные отверстия мини-зажима к резервуарам для среды, а выпускные отверстия — к шприцам. Затем установите шприцы на шприцевой насос. Перенесите насос и чипсы в инкубатор.

Поместите средние резервуары на лед за пределами инкубатора. Работайте насосом в режиме отбора, втягивая среду из резервуара среды в камеру биореактора minijoint. Продолжайте этот процесс культивирования в течение 28 дней.

Чтобы смоделировать воспаление суставов и дегенерацию хряща, добавьте интерлейкин один бета к штамму фиброгенной среды в концентрации 10 нанограммов на миллилитр в течение семи дней. Обязательно замените шприц на третий день, прежде чем вводить свежий интерлейкин один бета в фиброгенную среду. Для тестирования лекарственного средства после трех дней лечения интерлейкином один бета вводите препарат либо в общую среду, имитируя внутрисуставное введение, либо во всех типах сред, имитируя системное введение.

После семи дней лечения интерлейкином один бета соберите отдельные ткани для анализа. После удаления вкладышей с помощью стерильных щипцов протолкните перфоратор для биопсии через центр вкладыша, чтобы удалить гель и поместить гель в PBS. Затем разрежьте остеохондральные гели пополам, оценивая экспрессию генов.

Соберите и центрифугируйте около 1,5 миллилитров среды из каждого источника среды при 14 000 г в течение 10 минут. После удаления осадка подвергните кондиционированную среду мгновенной заморозкой в жидком азоте. Для гистологического окрашивания и иммуноокрашивания сначала фиксируют остеохондральную и синовиально-подобную фиброзную ткань, или образцы SFT, в 10%-ном буферном формалине и обезвоживают их в этаноле возрастающих концентраций.

Очистите образец в ксилоле, поместите его в парафин и, наконец, разделите образцы на шесть микрометров толщиной. В случае жировой ткани окрашивайте формальные и фиксированные образцы с 10%-ной буферизацией непосредственно масляным красным раствором O или BODIPY. Тканеспецифические фенотипы хорошо поддерживались для отдельных микротканей.

Все ткани мини-сустава были собраны для анализа их фенотипов после 28 дней культивирования. Костный компонент микротканей костно-хрящевых звеньев экспрессировал высокий уровень остеокальцина. В хрящевой части остеохондрального отдела ткани экспрессируют значительно высокие уровни коллагена второго типа и аггрекана.

Уровни экспрессии репрезентативных адипогенных генов, адипонектина и лептина были выше в жировой ткани. Отложение минералов кальция, щелочной фосфатазы и белка остеокальцина в основном наблюдалось в костном размере остеохондральных микротканей. Хрящевая сторона костно-хрящевых тканей показала хорошо удерживаемые гликозаминогликаны и коллаген второго типа.

Экспрессия маркеров, связанных с гипертрофией хондроцитов, коллагена типа 10 и индийского ежа, была значительно снижена после 28 дней культивирования. В жировой ткани обнаружено обильное отложение липидных капель. Иммунофлуоресцентное окрашивание показало надежную экспрессию смазки и кадгерина 11 SFT после четырех недель культивирования.

В модели заболевания лечение IL one beta приводило к апоптозу клеток и повышению уровня MMP-13 в SFT. Деградация хряща лечилась IL one beta, что свидетельствует о возникновении перекрестных помех между костно-хрящевой тканью и SFT. Терапевтическая эффективность напроксена при системном введении показала снижение деградации хряща в одном бета-минисуставе IL.

ПЦР в реальном времени показала, что четыре потенциальных препарата для лечения остеоартрита, модифицирующих болезнь, частично обратили вспять потерю хряща. Наиболее важными этапами этой процедуры являются сшивание гелей во вставках и размещение вставки в биореакторе. Чип позволяет исследовать вклад других факторов риска, предлагаемых при остеоартрите, таких как ожирение и механические травмы.

Он также может быть использован для изучения других заболеваний суставов.