Гипертермия, генерируемая высокоинтенсивным сфокусированным ультразвуком под магнитно-резонансным контролем: возможный метод лечения на модели рабдомиосаркомы у мышей

Этот протокол позволяет проводить новые доклинические испытания гипертермии, нацеленной на опухоль, в сочетании с термочувствительными препаратами, которые могут применяться для улучшения выживаемости и снижения системной токсичности у пациентов с саркомой. Основное преимущество этого метода заключается в том, что высвобождение химиотерапии ограничено нагретой областью, максимизируя высвобождение лекарства внутри опухоли при минимизации системного высвобождения препарата в здоровых тканях. Наши методы могут быть переведены клинически для лечения сарком.

Кроме того, наша работа заключается в изучении того, как локализованное переохлаждение может спровоцировать иммунную систему, чтобы помочь организму бороться с раком наряду со стандартной химиотерапией. Продемонстрируют процедуру доктор Уоррен Фольц, ведущий физик МРТ в Инновационном центре Star, доктор Адам Уосп, ведущий физик HIFU в больнице для больных детей, и Сюзанна Вонг, выпускница магистратуры в области прикладных наук из лаборатории Дрейка в больнице для больных детей в Торонто. Для начала побрейте заднюю ногу сдерживаемой мыши с помощью машинки для стрижки и протрите ее 70%-ным этанолом.

Аспирируют приблизительно 10 000 клеток в 10 микролитров раствора клеточной суспензии с помощью микролитрового шприца. Вытяните правую заднюю ногу мыши и равномерным движением введите клеточную суспензию в мускулатуру бедра с помощью микролитрового шприца с иглой 26 калибра. Иглу следует вводить параллельно бедренной кости по направлению к колену, стараясь не задеть седалищный нерв.

Извлеките иглу и верните мышь во вторую клетку. Ежедневно оценивайте животных и контролируйте их задние конечности на предмет роста опухоли путем пальпации. Изображение анестезированной мыши с помощью МРТ-сканера.

На взвешенном изображении Т2 обратите внимание на простые размеры и количество осевых срезов, в которых появляется опухоль. Обратите внимание на расположение опухоли по отношению к бедренной кости и боковой поверхности бедра, куда войдет ультразвуковая волна. Чтобы подготовить малокалиберную систему HIFU, включите генератор, наденьте мембрану на преобразователь и заполните преобразователь достаточным количеством деионизированной воды, пока мембрана не расширится ниже преобразователя.

Но не настолько твердый, чтобы он сжимал мышь. Дегазируйте воду в контуре преобразователя в течение 30 минут, чтобы удалить растворенный кислород из среды. После обезболивания мыши и переноса ее в носовой конус нанесите на глаза смазку роговицы, чтобы предотвратить повреждение из-за отсутствия рефлекса моргания под наркозом.

Побрейте правую заднюю конечность мыши. Нанесите крем для депиляции на выбритую область, включая всю правую заднюю конечность. Поместите мышь под нагревательную лампу, находясь в шкафу биобезопасности, чтобы помочь с терморегуляцией.

И удалите волосы и крем для депиляции через минуту после нанесения. Переместите мышь в носовой конус, совместимый с МРТ, на салазках МРТ и поместите мышь неопулевой несущей стороной вниз, а опухоль превосходит опухоль внутрь держателя для мыши, напечатанного на 3D-принтере, на салазках. Поместите тепловую лампу рядом с мышью, чтобы она оставалась теплой.

При необходимости обрежьте сжатый сегмент ультразвуковой гелевой подушечки, чтобы подложить под мышь нижнюю часть держателя толщиной, чтобы выровнять опухоль до верхней части держателя. Оттяните невовлеченную ногу от опухолевой ножки либо под мышь, либо вытянутую с согнутой опухолевой ногой. Убедитесь, что ноги не находятся в ближней или дальней зоне опухоли и пути ультразвукового луча.

Чтобы вставить датчик температуры пищевода, проденьте пищеводный зонд через носовой конус и почистите шею мыши. Наклоните нос мыши вверх, чтобы создать линию от ее рта прямо к животу, вытянув голову. Проведите термозондом над языком примерно на 0,5 сантиметра в пищевод мыши и замените носовой конус вокруг носа мыши.

Закрепите пищеводный зонд и носовой конус в верхней части салазок. Далее вставьте ректальный датчик температуры и закрепите его скотчем. При необходимости вставьте еще одну гелевую подушечку и нанесите смазку для глаз или ультразвуковой гель вокруг правой задней конечности, чтобы заполнить пробелы.

Вставьте катетер для хвостовой вены иглы бабочки 27 калибра в боковую хвостовую вену, прикрепленную к микротрубке с 40 микролитрами мертвого пространства и надежно заклейте ленту. Поместите респираторный монитор с соединительным кабелем к голове мыши, чтобы он не мешал размещению ультразвукового датчика, закрепите его лентой. Используйте двух человек, чтобы перенести подготовленную мышь, мышиные санки, анестезиологическую линию, дыхательную линию, катетер для хвостовой вены и шнуры теплового зонда в сканер МРТ и поместить их в держатель салазок МРТ.

Все были проверены, и в комплект МРТ не поступило ничего, что было бы ферромагнитным или могло быть повреждено в сильном магнитном поле системы. После того, как оператор программного обеспечения HIFU переместит мениск датчика непосредственно над опухолью для первоначального выравнивания, нанесите смазку для глаз или дегазированный ультразвуковой гель на безволосую кожу над опухолью и соедините датчик HIFU с областью опухоли. Подключите линию подачи лекарства от автоматического насоса к катетеру хвостовой вены и рассчитайте количество мертвого пространства в линии хвостовой вены и соединительной линии.

Сдвиньте салазки мыши HIFU по направляющим МРТ в центр МРТ и поместите устройство для обогрева конвекции воздуха на самую теплую настройку. Направьте трубку, выдувающую воздух, на мышь в центре отверстия МРТ и закрепите ее лентой. Позже разогревающее устройство будет переведено на самое низкое значение, чтобы предотвратить перегрев мыши во время обработки ультразвуком.

Получите обзорные МР-изображения как осевых, так и сагиттальных изображений, чтобы определить местоположение опухоли для нацеливания ультразвуком, включая глубину. Отрегулируйте положение датчика соответствующим образом с помощью программного обеспечения HIFU, вставив желаемое расстояние перемещения, измеренное на изображении, а затем щелкнув направление стрелки для перемещения. Также обратите внимание на расположение дрейфовой трубы.

При необходимости повторите. Определите местоположение фокального пятна преобразователя в плоскости корнала, выполнив короткую непрерывную обработку ультразвуком 50 милливольт в течение пяти секунд во время получения термометрии тестового выстрела. Совместите снимки МРТ с изображением фокального пятна в программном обеспечении HIFU.

Просмотрите изображения на предмет расположения опухоли относительно костной структуры и прямой кишки и измените положение датчика по мере необходимости. Повторите тестовый выстрел ультразвуком во время девяти повторений тепловизионного изображения, чтобы подтвердить, есть ли равномерный и точный нагрев в объеме опухоли с минимальным нецелевым нагревом. Отрегулируйте расположение среза, расположение датчика и глубину рулевого управления и подтвердите эффективность нагрева с помощью повторных тестовых снимков по мере необходимости.

Используя программное обеспечение для мониторинга лечения HIFU, определите интересующую область или ROI для термометрического мониторинга в конечном профиле нагрева, измерив расстояние для перемещения, а затем изменив координаты сетки в программе. Установите ROI в сигнале жидкости от дрейфовой трубки для коррекции дрейфа выходных данных термометрии. Если этот жидкостный сигнал не четко определен на осевом планирующем изображении на уровне опухоли, то для коррекции дрейфа используется прямой выход волоконно-оптического датчика температуры внутри дрейфовой трубки.

Введите базовую температуру на основе температуры ректального зонда для термометрических измерений. Откройте спецификации 20-минутного лечения гипертермией в программном обеспечении и начните обработку ультразвуком после того, как будут собраны эталонные МР-изображения и начнется термометрия. Выполните 20-минутную обработку во время тепловизионной съемки с помощью встроенного программного обеспечения контроллера пропорциональной интегративной производной или PID.

Вводят выбранный препарат через 1,5 минуты после того, как температура в РОИ нагреется до нужной температуры. Если ректальная температура быстро растет во время лечения и превышает 40 градусов по Цельсию, остановите обработку ультразвуком и дайте ректальной температуре упасть перед перезапуском. После завершения лечения извлеките мышь из отверстия МРТ, обеспечив гемостаз в месте введения катетера хвостовой вены, и перенесите ее в кабинет биобезопасности.

Смыть ультразвуковой гель и смазку с задней ноги с помощью воды. Перенесите мышь в клетку и следите за ее восстановлением. Направьте нагревательную лампу на один конец клетки, чтобы облегчить терморегуляцию во время восстановления.

Используя этот протокол гипертермии, опухоли в задней конечности можно было последовательно нагревать до желаемой заданной температуры в течение всего периода лечения. Температура, контролируемая во время репрезентативного лечения, показана на этом рисунке. Здесь представлены средние температуры верхнего 10-го процентиля и верхнего 90-го процентиля всех вокселей в ROI.

Средние температуры во время лечения в пределах ROI для каждой мыши были протестированы на этапе оптимизации со стандартным отклонением. Также показана общая средняя температура. Показатели успешности лечения гипертермией также улучшились с течением времени.

Успех лечения зависел от критериев включения. Это системная температура, температура опухоли и вариация с ROI и отсутствие дистального нагрева. Здесь синяя линия представляет процент мышей, для которых лечение было успешным, а оранжевые полосы представляют количество обработанных мышей.

Каждая обработка относится к отдельной дате, в которую проводились эксперименты. Чтобы определить оптимальное время лечения гипотермией для дальнейших исследований, были протестированы две продолжительности лечения: 10 минут и 20 минут. Высокоэффективная жидкостная хроматография и масс-спектрометрия, или ВЭЖХ МС, использовались для оценки количества доксорубицина в опухолях и количественной оценки разницы в накоплении доксорубицина между тестируемыми продолжительностями.

Результаты демонстрируют значимость между количеством доксорубицина в опухоли в 20-минутной термочувствительной группе липосомального доксорубицина плюс гипертермия по сравнению с нормальным контролем термии. Никаких различий в опухоли в группах свободного доксорубицина не наблюдалось. При подготовке и размещении массы крайне важно, чтобы луч HIFU был беспрепятственным.

Следует избегать пузырьков воздуха в геле или кости на пути луча. Мы собираем ткани и кровь для анализа фармакокинетики и уровней токсичности в различных органах, а также изучаем немедленную и отсроченную реакцию иммунной системы на лечение.