Анализ пустоты в реальном времени

Метод, описанный в этом отчете, может быть использован для понимания физиологических и нейроповеденческих аспектов произвольного мочеиспускания при состояниях здоровья и болезнях. Этот метод позволяет нам отслеживать поведение мыши в светлую и темную фазы дня и предоставляет временную, пространственную и объемную информацию о событиях мочеиспускания. Чтобы подготовить анализ пустоты в реальном времени или записывающую камеру RT-VSA, поместите тонкую или плотную фильтровальную бумагу, в зависимости от времени суток, на дно записывающей клетки RT-VSA.

Поверх фильтровальной бумаги поместите пластиковое иглу для спального места, стерильную микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 мл для обогащения и пластиковую тарелку размером 60 мм x 15 мм, содержащую два или три кусочка сухого корма для мыши, и от 14 до 16 граммов воды в виде гелевого пакета. Как только записывающая камера будет готова, аккуратно поместите мышь на фильтровальную бумагу. Убедитесь, что перенос мыши из клетки корпуса в отсек для записи происходит с минимальной нагрузкой.

Как только мышь окажется внутри клетки для записи, установите крышку и накройте верхнюю часть крышки впитывающей синей подушечкой, чтобы свести к минимуму прямые отражения окружающего света на поверхности крышки из плексигласа. Включите ультрафиолет в нижней камере. Для записи видео RT-VSA с верхней и нижней камер используйте программное обеспечение для записи видеонаблюдения, настроенное на одновременную запись с нескольких веб-камер или сетевых камер.

Инициируйте запись, нажав Cmd R в окне программы. Выполняйте видеозаписи со скоростью один кадр в секунду. Сразу после начала записи выйдите из комнаты и осторожно закройте дверь.

Следите за тем, чтобы в комнате было тихо на протяжении всего эксперимента. Остановите запись, нажав Cmd T.Выключите ультрафиолетовое излучение. После остановки записи программа автоматически генерирует видеофайл в формате m4v для каждой камеры и сохраняет его под именем камеры в ранее выбранной папке назначения.

Убедитесь, что в папке каждой камеры эксперименты упорядочены по датам. Убедитесь, что в каждой папке даты или эксперимента есть один файл m4v и все отдельные файлы jpeg, соответствующие каждому кадру фильма. Создайте на рабочем столе папку с названием и датой эксперимента и перенесите в нее файлы m4v.

Скопируйте папку с фильмом на флэш-накопитель для анализа на внешнем компьютере. Откройте для анализа видеофайл, собранный нижней камерой во время светлой фазы или верхней камерой во время темной фазы. Оценив качество фильма, проанализируйте эксперименты, перейдя к правильному временному окну с помощью команды перемотки вперед или ползунка временной шкалы.

Активность мочеиспускания во время светлой фазы регистрируется между 11:00 и 17:00, а во время темной фазы - с полуночи до 6:00. Воспроизведите фильм в режиме ускоренной перемотки вперед, щелкнув значок перемотки вперед, или вручную прокрутите фильм, ища доказательства того, что мышь опорожняется. Обратите внимание на внезапное появление ярких пятен мочи на фильтровальной бумаге или изменения в поведении, включая движение к углам клетки и короткий период бездействия, когда мышь опорожняется. Зарегистрируйте время, в которое возникает каждая пустота.

Как правило, время пустоты регистрируется при первых признаках обнаружения мочи. Чтобы измерить пустоту, сначала используйте полосу прокрутки, чтобы переместиться вперед или назад во времени, ища точку, когда произошла максимальная диффузия пятна мочи. На этом этапе поставьте фильм на паузу и поместите стрелку компьютерной мыши в место анализа, чтобы отметить интересующее место на снимке экрана.

Назовите файл снимка экрана, используя корреляционные числа, чтобы учесть порядок появления в фильме. После того, как все пустоты будут проанализированы, измерьте общую площадь фильтровальной бумаги, сделав снимок экрана и очертив границу фильтровальной бумаги. Рассчитайте процентную площадь каждого из пятен мочи.

Преобразуйте значения процентной площади в объем мочи для каждого пустотного пятна, используя калибровочные кривые и функцию интерполяции в программном обеспечении для построения графиков. Мочеиспускание самок и самцов мышей Piezo1, 2, нокаутных и контрольных мышей регистрировалось в темную и светлую фазу дня. Во время их неактивной световой фазы не наблюдалось существенных различий в каких-либо параметрах, проанализированных для самок или самцов мышей с нокаутом по сравнению с контролем.

Однако в активной темновой фазе у самок и самцов мышей с нокаутом наблюдался измененный фенотип мочеиспускания, характеризующийся значительным увеличением количества и общего объема мелких пустотных пятен. Не было существенных различий в первичных пятнах пустот или количестве PVS, среднем объеме на PVS или общем объеме PVS у самок или самцов мышей с нокаутом по сравнению с контрольными мышами. Мочеиспускание самок мышей было протестировано в базальных условиях и после лечения циклофосфамидом.

По сравнению с базальными состояниями, количество выделения мочи в мочеиспускании меньше после лечения циклофосфамидом, а события мочеиспускания происходят гораздо чаще. Одним из ключевых аспектов воспроизводимости анализа является максимально осторожное манипулирование животными и минимальное напряжение в течение всего периода испытаний. Поскольку это неинвазивный анализ, после него могут быть выполнены дополнительные процедуры, включая цитометрия и электромиографию, для оценки функций сфинктера мочевого пузыря и наружной уретры соответственно.

Реализация этого метода позволит исследователям определить вклад конкретных путей в поведение при мочеиспускании в состоянии здоровья и болезнях.