Имплантация внутричерепных канюль для серийных локорегионарных инфузий Т-клеток химерного антигенного рецептора (CAR) у мышей
24 февраля 2023 г.
Опухоли центральной нервной системы (ЦНС) являются основной причиной смерти от рака у детей, и локорегионарная иммунная терапия все чаще тестируется на пациентах в клинических испытаниях. В этом протоколе описываются методы локорегионарной имплантации канюли мышам для доклинической оценки иммунотерапевтических инфузий, нацеленных на опухоли ЦНС.
Этот протокол воспроизводит внутрижелудочковую катетерную систему, используемую в текущих клинических испытаниях для проверки местной региональной доставки CAR T-клеточной терапии, направленной против опухолей центральной нервной системы. Основным преимуществом данной методики является возможность проведения многократных повторных доз локальной регионарной CAR T-клеточной терапии без выполнения множественных инвазивных хирургических процедур. Эта система может быть использована для исследования различных терапевтических средств в разных местах доставки и, таким образом, может дать представление о множестве областей исследований в области неврологии.
Для начала поместите анестезированную мышь с бритой головой на операционный стол и осторожно откройте нижнюю часть стереотаксической руки с помощью шпателя. Вставьте канюлю щипцами и закрепите ее, затянув винт на руке, пока от половины до двух третей белой пластиковой части и пяти миллиметров канюли не будут выступать из нижней части отверстия. Вставьте и закрепите верхние зубы мыши в стержне прикуса стереотаксического аппарата.
Потяните носовой конус вперед и затяните его, убедившись, что мышь вдыхает изофлуран. Затем установите мышь на подогретый стереотаксический аппарат с помощью амбушюр или амбушюр, избегая чрезмерного давления. Продезинфицируйте место операции и сделайте разрез параллельно черепу, как описано в рукописи.
Используйте ватные палочки, чтобы отодвинуть фасцию. Определите ориентиры, брегму и лямбду на черепе, соответствующие передним и задним отметкам, где встречаются черепные пластины. Чтобы создать поверхность для крепления акрила, аккуратно сделайте несколько разрезов поперек черепа с помощью скальпеля.
Используя стереотаксическую руку, локализуйте канюлю до интересующего ориентира. Поднимите наконечник канюли на один-два миллиметра над поверхностью черепа и двигайтесь к нужным координатам. Используя иглу 18 калибра или хирургическую дрель, сделайте два отверстия для винтов на обнаженном черепе вдали от места входа канюли, обеспечив достаточно места для канюли.
Прокрутите сверло через отверстие для винта, пока оно не прикрепится к черепу. С помощью отвертки с плоским наконечником вставьте и закрепите два винта в отверстия. Затем осторожно потяните винт вверх, чтобы убедиться, что он закреплен.
Для введения канюли создайте отверстие в черепе по указанным координатам с помощью иглы 18 калибра или хирургического сверла. Используя стереотаксическую руку, опустите канюлю до нужной координаты DV. Примерно 0,3 грамма порошка акриловой смолы и от 10 до 15 капель жидкости в фарфоровой 12-луночной пластине загрузите подготовленный вязкий материал белого цвета в шприц объемом один миллилитр.
Покройте череп и заполните промежутки вокруг канюли и винта. Ослабьте винт на стереотаксическом рычаге, пока цемент гибкий. Аккуратно используйте шпатель, чтобы освободить канюлю от держателя в нижнем отверстии и убрать стереотаксическую руку от мыши.
Как только цемент высохнет, вставьте фиктивную канюлю в направляющую канюлю и поверните по часовой стрелке, чтобы плотно закрепить ее. Как только процедура будет завершена, верните мышь в ее подогретую домашнюю клетку для восстановления. Чтобы приготовить лечебную канюлю, вставьте ее верхнюю часть в трубку PKG.
Затем наполните лечебный шприц суспензией CAR T-клеток и вставьте его через другой конец трубки PKG, закрывая верхнюю часть лечебной канюли. После обезболивания мыши зафиксируйте направляющую канюлю у основания с помощью щипцов. Открутите и извлеките фиктивную канюлю, открыв доступ к направляющей канюле.
Вливайте CAR T-клетки в течение одной минуты и удерживайте лечебную канюлю на месте еще минуту. После удаления лечебной канюли плотно закрутите фиктивную канюлю. Затем вводите мелоксикам подкожно для контроля боли.
Терапия CAR T-клетками, направленная на GPC2, вызвала значительную регрессию опухоли в медуллобластоме и значительно увеличила выживаемость в модели глиомы талиамической диффузной средней линии. При введении направляющей канюли во внутриопухолевое место важно понимать, что дорсально-вентральные координаты могут быть более поверхностными, чем инъекция опухоли, чтобы учесть длину проекции манекена и лечебной канюли.
Обзор
В данном протоколе описывается метод имплантации локорегиональных канюль мышам для облегчения доклинической оценки иммунотерапевтических инфузий, направленных на опухоли центральной нервной системы. Данная методика позволяет многократно вводить препараты CAR T-клеточной терапии без необходимости проведения нескольких инвазивных операций.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Нейробиология
- Онкология
- Иммунотерапия
Теоретическая часть
- Опухоли ЦНС являются основной причиной смертности от рака среди детей.
- В ходе клинических исследований тестируются методы локально-региональной иммунотерапии.
- Терапия CAR-T-клетками демонстрирует перспективность в воздействии на опухоли ЦНС.
- Данный протокол воспроизводит систему интравентрикулярного катетера, используемую в текущих клинических исследованиях.
Цель исследования
- Оценить эффективность терапии CAR T-клетками на доклинической модели.
- Представить метод локального регионарного введения терапевтических средств.
- Минимизировать инвазивность повторных процедур лечения на моделях животных.
Используемые методы
- Имплантация канюли с использованием стереотактического аппарата.
- Введение CAR T-клеточной терапии через имплантированную канюлю.
- Применение анестезии и хирургических методов для обеспечения благополучия животных.
- Мониторинг ответа опухоли и показателей выживаемости после лечения.
Основные результаты
- Терапия CAR-T клетками, направленными против GPC2, вызвала значительную регрессию опухоли.
- В модели диффузной глиомы срединных структур таламуса наблюдалось значительное продление выживаемости.
- Данный метод позволяет осуществлять точную доставку препарата в целевые области.
- Полученные данные могут быть использованы в будущих исследованиях в области нейробиологии и онкологии.
Выводы
- Данный протокол представляет собой ценный инструмент для изучения опухолей ЦНС.
- Он расширяет понимание эффективности CAR T-клеточной терапии.
- Данный подход может привести к совершенствованию терапевтических стратегий лечения опухолей ЦНС.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для отрасли
Последовательная имплантация интракраниальных канюль позволяет осуществлять повторную локорегионарную доставку CAR T-клеток в доклинических моделях опухолей ЦНС, что напрямую решает проблему оценки иммунотерапии в анатомически и патологически релевантных системах. Данный подход повышает прогностическую уверенность при переходе к трансляционным исследованиям, поскольку он имитирует клиническую доставку с помощью катетеров и обеспечивает надежную количественную оценку терапевтических режимов. Эта платформа стратегически предназначена для валидации мишеней и разработки стратегий дозирования в рамках портфелей препаратов для лечения онкологических заболеваний ЦНС у детей и взрослых.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Первичный поиск и валидация мишени
- Позволяет функционально оценить эффективность CAR T-клеток против валидированных антигенов опухолей ЦНС in vivo.
- Способствует снижению механистических рисков путем изоляции локально-региональных эффектов и минимизации системных искажающих факторов.
- Обеспечивает возможность итеративной проверки гипотез относительно взаимодействия с мишенью и опухолевого ответа.
Скрининг и разработка анализа
- Обеспечивает стандартизированную, воспроизводимую платформу для серийного введения доз и измерения отклика.
- Позволяет проводить количественную оценку регрессии опухоли и выживаемости после повторных инфузий CAR T-клеток.
- Служит основой для разработки анализа с целью оценки терапевтических эффектов, специфичных для места введения.
Трансляционные и доклинические исследования
- Приводит доклинические методы введения в соответствие с клиническими протоколами на основе катетеров для обеспечения трансляционной преемственности.
- Позволяет принимать решения о дальнейшем продвижении с учетом рисков на основе надежных серийных данных in vivo.
- Обеспечивает возможность проведения исследований биомаркеров и фармакодинамики на ортотопических моделях опухолей ЦНС.
Интеграция конвейера и рабочего процесса
Данный метод связывает этап раннего поиска и доклиническую валидацию, обеспечивая возможность серийного, сайт-специфического введения препаратов для иммунотерапии в ортотопических моделях опухолей ЦНС, что способствует идентификации перспективных соединений и проведению трансляционных исследований.
- Фундаментальная биология: способствует проверке гипотез при тестировании конструкций CAR T-клеток и мишеней опухолевых антигенов in vivo.
- Скрининг: стандартизирует повторное введение доз и количественное измерение опухолевого ответа для определения приоритетности кандидатов.
- Аналитика: предоставляет данные о выживаемости и регрессии опухоли для сравнительного анализа различных режимов и мест введения.
- Трансляционные исследования: имитирует клиническое введение с помощью катетера, поддерживая согласованность рабочих процессов при переходе от доклинического этапа к клиническому.
- Корпоративное повторное использование: adaptable для тестирования различных методов клеточной терапии и новых препаратов в моделях заболеваний ЦНС.
Операционное и корпоративное влияние
- Научная ценность: повышает прогностическую достоверность и снижает механистическую неопределенность в исследованиях иммунотерапии ЦНС.
- Операционная ценность: обеспечивает стандартизированное, воспроизводимое и масштабируемое серийное введение доз в доклинических моделях.
- Стратегическая ценность: улучшает качество принятия решений о продолжении или прекращении разработки (go/no-go) и эффективность использования капитала в программах онкологии ЦНС.
- Влияние на портфель: поддерживает приоритизацию с учетом рисков и продвижение перспективных иммунотерапевтических кандидатов.
Рекомендации по внедрению
- Требуется опыт в области стереотаксической хирургии и проведении процедур на ЦНС мелких животных.
- Необходим доступ к стереотаксическому аппарату, хирургическим инструментам и аналитической инфраструктуре для мониторинга опухоли.
- Требуется межгрупповая стандартизация дозирования, протоколов инфузии и критериев ответа.
- Метод может быть адаптирован к различным моделям опухолей ЦНС и координатам введения при оптимизации протокола.
- Воспроизводимость результатов зависит от точного анатомического таргетинга и послеоперационного ухода за животными.
