Имплантация внутричерепных канюль для серийных локорегионарных инфузий Т-клеток химерного антигенного рецептора (CAR) у мышей

Этот протокол воспроизводит внутрижелудочковую катетерную систему, используемую в текущих клинических испытаниях для проверки местной региональной доставки CAR T-клеточной терапии, направленной против опухолей центральной нервной системы. Основным преимуществом данной методики является возможность проведения многократных повторных доз локальной регионарной CAR T-клеточной терапии без выполнения множественных инвазивных хирургических процедур. Эта система может быть использована для исследования различных терапевтических средств в разных местах доставки и, таким образом, может дать представление о множестве областей исследований в области неврологии.

Для начала поместите анестезированную мышь с бритой головой на операционный стол и осторожно откройте нижнюю часть стереотаксической руки с помощью шпателя. Вставьте канюлю щипцами и закрепите ее, затянув винт на руке, пока от половины до двух третей белой пластиковой части и пяти миллиметров канюли не будут выступать из нижней части отверстия. Вставьте и закрепите верхние зубы мыши в стержне прикуса стереотаксического аппарата.

Потяните носовой конус вперед и затяните его, убедившись, что мышь вдыхает изофлуран. Затем установите мышь на подогретый стереотаксический аппарат с помощью амбушюр или амбушюр, избегая чрезмерного давления. Продезинфицируйте место операции и сделайте разрез параллельно черепу, как описано в рукописи.

Используйте ватные палочки, чтобы отодвинуть фасцию. Определите ориентиры, брегму и лямбду на черепе, соответствующие передним и задним отметкам, где встречаются черепные пластины. Чтобы создать поверхность для крепления акрила, аккуратно сделайте несколько разрезов поперек черепа с помощью скальпеля.

Используя стереотаксическую руку, локализуйте канюлю до интересующего ориентира. Поднимите наконечник канюли на один-два миллиметра над поверхностью черепа и двигайтесь к нужным координатам. Используя иглу 18 калибра или хирургическую дрель, сделайте два отверстия для винтов на обнаженном черепе вдали от места входа канюли, обеспечив достаточно места для канюли.

Прокрутите сверло через отверстие для винта, пока оно не прикрепится к черепу. С помощью отвертки с плоским наконечником вставьте и закрепите два винта в отверстия. Затем осторожно потяните винт вверх, чтобы убедиться, что он закреплен.

Для введения канюли создайте отверстие в черепе по указанным координатам с помощью иглы 18 калибра или хирургического сверла. Используя стереотаксическую руку, опустите канюлю до нужной координаты DV. Примерно 0,3 грамма порошка акриловой смолы и от 10 до 15 капель жидкости в фарфоровой 12-луночной пластине загрузите подготовленный вязкий материал белого цвета в шприц объемом один миллилитр.

Покройте череп и заполните промежутки вокруг канюли и винта. Ослабьте винт на стереотаксическом рычаге, пока цемент гибкий. Аккуратно используйте шпатель, чтобы освободить канюлю от держателя в нижнем отверстии и убрать стереотаксическую руку от мыши.

Как только цемент высохнет, вставьте фиктивную канюлю в направляющую канюлю и поверните по часовой стрелке, чтобы плотно закрепить ее. Как только процедура будет завершена, верните мышь в ее подогретую домашнюю клетку для восстановления. Чтобы приготовить лечебную канюлю, вставьте ее верхнюю часть в трубку PKG.

Затем наполните лечебный шприц суспензией CAR T-клеток и вставьте его через другой конец трубки PKG, закрывая верхнюю часть лечебной канюли. После обезболивания мыши зафиксируйте направляющую канюлю у основания с помощью щипцов. Открутите и извлеките фиктивную канюлю, открыв доступ к направляющей канюле.

Вливайте CAR T-клетки в течение одной минуты и удерживайте лечебную канюлю на месте еще минуту. После удаления лечебной канюли плотно закрутите фиктивную канюлю. Затем вводите мелоксикам подкожно для контроля боли.

Терапия CAR T-клетками, направленная на GPC2, вызвала значительную регрессию опухоли в медуллобластоме и значительно увеличила выживаемость в модели глиомы талиамической диффузной средней линии. При введении направляющей канюли во внутриопухолевое место важно понимать, что дорсально-вентральные координаты могут быть более поверхностными, чем инъекция опухоли, чтобы учесть длину проекции манекена и лечебной канюли.