Препарат лентивирусного вектора для эффективной модуляции генов и микроРНК резидентных макрофагов перитонеальной полости in vivo у мышей
16 февраля 2024 г.
Мы демонстрируем пошаговый протокол исследования функции генов в перитонеальных тканевых резидентных макрофагах in vivo с использованием лентивирусных векторов.
По сравнению с другими вирусными подходами для манипулирования генами in vivo в макрофагах, использование лентивирусных векторов обеспечивает стабильную интеграцию трансгенных тканевых макрофагов, эффективную экспрессию трансгенов и самый большой предел размера вектора. При использовании in vivo лентивирусных манипуляций с метаболическими ферментами мы обнаружили заметные функциональные изменения в тканевых резидентных макрофагах. Поэтому в настоящее время мы исследуем иммунометаболизм и его роль в сохранении специфических функций тканей, включая эпигенетику и иммунную функцию.
В будущем мы хотели бы сосредоточиться на определении того, как тканевые макрофаги влияют на другие локальные клеточные популяции во время гомеостаза и в моделях заболеваний, и как эти взаимодействия могут быть использованы для профилактики и лечения заболеваний.
Обзор
В данной работе представлен подробный протокол исследования функции генов в резидентных макрофагах брюшины in vivo с использованием лентивирусных векторов. Применение лентивирусных векторов обеспечивает стабильную интеграцию и эффективную экспрессию трансгенов в макрофагах.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Нейробиология
- Иммунология
- Генная терапия
Теоретическая часть
- Лентивирусные векторы обеспечивают стабильную интеграцию трансгенов.
- Они эффективны для манипуляций с генами in vivo в макрофагах.
- Понимание функций макрофагов имеет решающее значение для изучения иммунных ответов.
- Исследование иммунометаболизма может дать представление о тканеспецифических функциях.
Цель исследования
- Изучить роль тканевых макрофагов в функционировании генов.
- Оценить влияние метаболических ферментов на функциональность макрофагов.
- Исследовать взаимодействия между макрофагами и локальными популяциями клеток.
Используемые методы
- Подготовка компонентов лентивируса в контролируемой среде.
- Смешивание растворов для обеспечения надлежащей интеграции вирусных векторов.
- Манипуляции с макрофагами in vivo для изучения функции генов.
- Оценка функциональных изменений в макрофагах после проведения манипуляций.
Основные результаты
- Были отмечены значительные функциональные изменения в резидентных макрофагах тканей.
- Данный подход позволил получить новые сведения об иммунометаболизме.
- Исследование закладывает основу для дальнейшего изучения взаимодействий макрофагов.
- Были определены потенциальные возможности применения метода для профилактики и разрешения заболеваний.
Выводы
- Лентивирусные векторы эффективны для изучения функций генов в макрофагах.
- Понимание поведения макрофагов может помочь в разработке терапевтических стратегий.
- Будущие исследования будут сосредоточены на взаимодействиях макрофагов в норме и при патологии.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для промышленности
Модуляция экспрессии генов и микроРНК в резидентных макрофагах брюшины с помощью лентивирусных векторов позволяет проводить быстрый функциональный анализ путей иммунных клеток in vivo непосредственно в их физиологической нише. Данный подход повышает прогностическую достоверность при валидации мишеней и снижает механистические риски на этапе поиска, особенно для иммунометаболических и эпигенетических мишеней. Эффективность и специфичность данного протокола способствуют принятию обоснованных решений по управлению портфелем стратегий иммуномодуляции с учетом рисков.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Ранний поиск и валидация мишени
- Позволяет напрямую проверять гипотезы о функциях генов и микроРНК в резидентных макрофагах тканей in vivo.
- Способствует механистическому снижению рисков путем уточнения вклада иммунных путей в тканевой гомеостаз и патологию.
- Облегчает функциональную валидацию мишеней как в гомеостатическом, так и в воспалительном состояниях.
- Обеспечивает быструю оценку функции гена без необходимости использования трансгенных моделей целых животных.
Скрининг и разработка анализа
- Позволяет подготавливать валидированные модели in vivo для последующего скрининга иммуномодулирующих соединений.
- Обеспечивает воспроизводимую и количественно определяемую экспрессию трансгена в целевых популяциях макрофагов.
- Обеспечивает стандартизацию уровней инфицирования и зависимостей «доза трансгена — ответ».
- Поддерживает масштабируемую подготовку лентивирусных векторов для повторных или параллельных исследований.
Трансляционные и доклинические исследования
- Соответствует моделям релевантных заболеваний, обеспечивая возможность модуляции генов как в состоянии гомеостаза, так и при индуцированном перитоните.
- Обеспечивает непрерывность процесса от этапа поиска до доклинической валидации иммунных мишеней.
- Поддерживает разработку трансляционных биомаркеров, позволяя проводить считывание функции макрофагов in vivo.
- Снижает риски при внедрении иммуномодулирующих стратегий за счет уточнения тканеспецифических эффектов.
Интеграция конвейера и рабочего процесса
Данный протокол объединяет этапы раннего поиска и доклинических исследований, обеспечивая переход от валидации мишени к функциональному скринингу популяций иммунных клеток.
- Биология открытий: Обеспечивает проверку гипотез о роли генов и микроРНК в биологии макрофагов.
- Скрининг: Предоставляет количественные показатели инфекции и экспрессии для оценки готовности анализа.
- Аналитика: Позволяет измерять уровень инфекции, интенсивность экспрессии трансгена и динамику их сохранения in vivo.
- Трансляционные исследования: Связывает модуляцию макрофагов in vivo с моделями соответствующих заболеваний и стратегиями поиска биомаркеров.
- Корпоративное повторное использование: Предлагает многократно используемую платформу для быстрой оценки функций генов по различным иммунным мишеням.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: Повышает достоверность прогнозов при валидации иммунных мишеней и снижает механистическую неоднозначность.
- Операционная ценность: Стандартизирует модуляцию генов in vivo с высокой воспроизводимостью и эффективностью инфицирования.
- Стратегическая ценность: Ускоряет принятие решений о продолжении или прекращении разработки (go/no-go) и снижает зависимость от трудоемких трансгенных моделей.
- Влияние на портфель: Позволяет проводить приоритезацию иммуномодулирующих активов с учетом рисков на основе функциональных данных in vivo.
Особенности реализации
- Требуется опыт работы по подготовке лентивирусных векторов и методам доставки in vivo.
- Необходим доступ к ультрацентрифугированию и аналитической инфраструктуре на основе флуоресценции.
- Требуется межкомандная стандартизация протоколов инфицирования и метрик считывания данных.
- Может потребоваться адаптация для других популяций резидентных макрофагов тканей или моделей заболеваний.
- Ограничения протокола включают кратковременность инфекции и воспаление низкой степени, вызванное внутрибрюшинным введением.
