Name: Натурные съемки Мышь Thymus Использование 2-Фотон микроскопии (Видео) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-01-25T19:52:00.000+00:00
Duration: 15 min
Description: Изучите метод двухфотонной микроскопии для исследования миграции клеток в тимусе мыши. Этот протокол позволяет наблюдать динамику Т-клеток в реальном времени и изучать механизмы иммунологического развития.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Мы благодарим Мэтта Павел и Джимми Ву для оказания технической помощи.

Приемные Трансфер Inject новорожденных с 50-100 мкл костного мозга использованием инсулиновый шприц 2-4 раза в течение первых 3-7 дней жизни, с окончательным донор-хост соотношении 1:1. Стремитесь к инъекции ниже грудины и грудной клетки, но, прежде кишки и желудка. Вставьте иглу достаточно далеко, чтобы проникнуть в брюшину, осторожны, чтобы не проколоть мембрану. Она не является редкостью для некоторых из костного мозга, будут потеряны во время инъекции. Вы можете уменьшить потери, ослабив контроль над вашим щенком, как Вы вводите таким образом, чтобы дать коже расширяются и, затем, медленно удаления иглы. Препарирование Thymus Сделать разрез через среднюю линию и вырезать или разрыв кожи прочь раскрыть грудную клетку. Держитесь за грудиной и прорезать брюшины и диафрагмы. Нарежьте стороны грудной клетки, чтобы выявить грудной полости. Вилочковой железы лежит на верхней части сердца. Так, чтобы сохранить структуру тимуса, держаться за окружающие ткани, как вы рассекать из вилочковой железы. Промыть тимуса с PBS держать его от высыхания во время вскрытия. Аккуратно дразнить излишки ткани на поверхность капсулы тимуса и делить пополам две лопасти. Подготовка тканей для работы с изображениями Используйте ветеринарных клей ткани клеить тимуса не на поле, покровное. Используйте pipetteman поставить долю микролитр клея. Распространение клей приблизительную продолжительность и ширина тимуса. Устойчивый тимуса против покровное и перетащить его на место. Два-Фотон изображений Ткань погружается в DMEM без фенола красного, который перфузии с 95% кислорода и 5% углекислого газа и нагревают до 37 ° C. Двухфотонного возбуждения была достигнута с помощью Spectra-Physics Maitai лазера, настроенного на 900 нм, и CFP, GFP, YFP и Техас Красное свечение было отделено использованием 495, 515, 560 дихроичных зеркал и собранные с помощью ФЭУ детекторов.

<ol><li>Kyewski, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Seeding+of+thymic+microenvironments+defined+by+distinct+thymocyte-stromal+cell+interactions+is+developmentally+controlled%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Seeding of thymic microenvironments defined by distinct thymocyte-stromal cell interactions is developmentally controlled.</a> J Exp Med. 166, 520-538 (1987).</li>
<li>Ladi, E., Yin, X., Chtanova, T., Robey, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thymic+microenvironments+for+T+cell+differentiation+and+selection%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">Thymic microenvironments for T cell differentiation and selection.</a> Nat Immunol. 7, 338-343 (2006).</li>
<li>Witt, C. M., Raychaudhuri, S., Schaefer, B., Chakraborty, A. K., Robey, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+Migration+of+Positively+Selected+Thymocytes+Visualized+in+Real+Time%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Directed Migration of Positively Selected Thymocytes Visualized in Real Time.</a> PLoS Biol. 3, (2005).</li>
</ol>

Авторы не имеют конфликта интересов, требующего раскрытия.

Двухфотонное изображений в тимуса позволяет рассматривать в живых, неповрежденных органов взаимодействия и миграции, которые лежат в основе выбора события в тимусе.

Натурные съемки Мышь thymus Использование 2-Фотон микроскопии

In situ Imaging of the Mouse Thymus Using 2-Photon Microscopy

Двухфотонное микроскопия (TPM) позволяет нам образ глубоко в вилочковой железе и документировать события, которые имеют важное значение для развития тимоцитов. Для выполнения миграции физических лиц в толпе тимоцитов, мы генерируем новорожденных химерами, где менее чем один процент тимоцитов являются производными от донора, для трансгенных повсеместно выражают флуоресцентного белка. Для создания этих частичных кроветворения химеры, неонатальной получателей вводят костного мозга от 3-7 дней от роду. После 4-6 недель, мыши приносится в жертву и тимуса тщательно расчленены и bissected сохраняя архитектуру ткани, которая будет в образ. Тимус наклеиваются на покровное в рамках подготовки к бывшим естественных изображений по TPM. Во время визуализации тимус хранится в DMEM без фенола красного, который перфузии с 95% кислорода и 5% углекислого газа и нагревают до 37 ° C. Используя этот подход, мы можем изучать события, необходимые для генерации разнообразный репертуар Т-клеток.

Мы представляем шаг за шагом инструкции для поколения новорожденных химерами, а также вскрытие и подготовка тимуса для бывших естественных изображений на 2-Фотон микроскопии.

Натурные съемки Мышь Thymus Использование 2-Фотон микроскопии

Двухфотонная микроскопия (ДФМ) позволяет получать изображения глубоких слоев тимуса и фиксировать события, важные для развития тимоцитов. Для отслеживания...

Двухфотонная визуализация полезна для иммунологии, так как она позволяет отслеживать миграцию отдельной клетки при взаимодействии с окружающей средой. Отслеживая миграцию в тимусе с помощью двухфотонной микроскопии, мы можем охарактеризовать механизмы позитивной и негативной селекции.Здравствуйте, я Ина Лотти из лаборатории доктора Эллен Роби в Калифорнийском университете в Беркли. А я Пол Херцмарк, также из лаборатории Эллен Роби. Сегодня мы покажем вам, как мы проводим визуализацию тканей тимуса in situ, и я продемонстрирую, как использовать наш двухфотонный микроскоп для получения изображений тимуса.Я продемонстрирую этапы подготовки к двухфотонной визуализации. Они включают в себя следующие процедуры: выделение гемопоэтических стволовых клеток из костного мозга, адаптивный перенос клеток костного мозга новорожденным, препарирование и бисекция тимуса, а также подготовка ткани для визуализации методом двухфотонной лазерной сканирующей микроскопии. Итак, приступим.Перед тем как подготовить тимус для визуализации, необходимо провести адаптивный перенос клеток костного мозга новорожденной мыши. Эти клетки костного мозга были выделены из задних конечностей трансгенных мышей с повсеместной экспрессией GFP. В данном инсулиновом шприце находится 50 µL костного мозга.Мы выполняем от двух до четырех инъекций хозяевам в возрасте от трех до семи дней, используя костный мозг одного донора для каждого инъецируемого щенка. Перед нами щенок в возрасте пяти дней; оттяните кожу, чтобы зафиксировать щенка во время инъекции и натянуть кожный покров. Выберите место введения ниже легких и грудной клетки, но выше кишечника и желудка.Во время введения препарата ослабьте захват кожи, чтобы она могла расшириться. Наконец, медленно извлеките шприц, чтобы минимизировать потерю костного мозга. Мышам дают развиваться от четырех до шести недель, после чего тимус можно извлечь для визуализации.Через четыре-шесть недель тимус можно удалить. Для визуализации я буду использовать набор больших пинцетов и ножниц, а также набор маленьких пинцетов и ножниц. Данная мышь была подвергнута эвтаназии в соответствии с нашим протоколом использования животных и обработана этанолом.Я буду использовать большой зажим, чтобы захватить кожу и сделать разрез по срединной линии. Теперь я могу либо использовать ножницы, чтобы разрезать ткани по срединной линии, либо отделить кожу от брюшины; я зафиксирую кожу булавками, чтобы открыть грудную полость. Чтобы разрезать брюшину, я буду опираться на грудину, после чего проникну в грудную полость через диафрагму и сделаю разрезы вдоль боковых сторон грудной клетки.И вы видите тимус, расположенный прямо над сердцем. Я верну их на место. Вот тимус.Я постараюсь его не касаться. Используйте пинцет поменьше, продолжая удерживать ткань вокруг тимуса. Хорошо, теперь я промою его PBS и начну удалять излишки ткани.Я буду использовать окружающие ткани тимуса в качестве опоры. При очистке тимуса я удалю избыточные ткани, осторожно срезая их ножницами. Также в тимусе есть две доли, которые необходимо разделить в процессе очистки.Но сначала я удалю все эти лишние кровеносные сосуды, расположенные на поверхности тимуса. Я действую очень осторожно, чтобы не нарушить архитектуру тимуса, которую мы будем визуализировать. Поэтому я удаляю только те ткани, которые находятся непосредственно на поверхности.Теперь я буду осторожно разделять две доли. Это вентральная и дорсальная доли, которые мы будем отделять, аккуратно разрезая ткань и раздвигая их. Чтобы ткань не пересохла, мы добавим немного PBS.Теперь я разделил две доли. Это дорсальная доля, которая имеет характерную форму гитары. А вот здесь находится вентральная доля.Я удалю излишки ткани с каждой из этих долей, чтобы область визуализации была свободна от лишних тканей. Однако я оставлю небольшое количество ткани, чтобы нам было за что удерживать образец. При визуализации нам пришлось бы проводить ее через эти излишки ткани, что совершенно не обязательно; их удаление позволит улучшить качество изображения.Теперь у нас есть две разделенные половины долей, готовые к закреплению на покровном стекле для визуализации. Для подготовки разделенного тимуса к визуализации вам понадобятся ветеринарный тканевый клей и покровные стекла размером 18 на 18 мм. Я предпочитаю использовать дозатор-пипетку, чтобы нанести на покровное стекло малую часть микролитра клея.Таким образом, я нанесу каплю клея длиной примерно с тимус, который мы будем визуализировать. Затем я распределю его по поверхности. Чтобы ширина капли соответствовала ширине тимуса, я помещу обе доли на одно и то же покровное стекло.Теперь я помещу еще один фрагмент прямо сюда. Я возьму дольку из избытка ткани, положу ее на покровное стекло и перемещу в область с клеем. То же самое я сделаю с другой долькой: снова коснусь покровного стекла там, где нет клея, чтобы зафиксировать руку, а затем положу вторую дольку тимуса на покровное стекло.Теперь, когда мы закрепили обе доли тимуса на покровном стекле, мы передадим его Полу для визуализации. Спасибо, Ина. Давайте возьмем этот образец и поместим его в среду DME, которую мы будем использовать для визуализации.Перед нами установка для двухфотонной микроскопии. Двухфотонная микроскопия очень эффективна для визуализации иммунных клеток, так как она позволяет глубоко заглянуть в тимус и наблюдать за перемещением флуоресцентных клеток. В данном методе используется импульсный инфракрасный лазер для возбуждения флуоресценции клеток.Наш микроскоп оснащен четырьмя различными камерами, которые позволяют нам одновременно визуализировать четыре разных цвета; при этом используется специальный объектив с 20-кратным увеличением. Эта специальная линза погружается в среду DMEM, в которой находится тимус, что обеспечивает числовую апертуру (NA) 0,95, которая очень высока и обеспечит высокую яркость наших клеток. Чтобы поддерживать жизнеспособность ткани, через среду DMEM пропускают смесь 95% O₂ и 5% CO₂.Затем раствор перекачивается в перфузионную камеру, где он нагревается до 37 °C; именно здесь погружены доли тимуса. С помощью этой системы мы можем поддерживать жизнеспособность клеток тимуса в течение четырех часов визуализации. Таким образом, я продемонстрировал вам, как настроить визуализацию для двухфотонного микроскопа.Теперь давайте рассмотрим некоторые из наших результатов на этом зацикленном видео. Здесь вы видите тимус, который мы визуализировали в четырех разных цветах. Красным цветом обозначены кровеносные сосуды тимуса, а желтым — дендритные клетки хозяина, экспрессирующие желтый флуоресцентный белок под контролем специфического для дендритных клеток промотора.Синие и зеленые тимоциты, которые вы здесь видите, получены от двух разных доноров, которых мы используем для создания неонатальной химеры методом адаптивного переноса, который Эна продемонстрировала вам ранее. Зеленые клетки — это тимоциты, экспрессирующие зеленый флуоресцентный белок, а синие клетки — тимоциты от донора, экспрессирующего голубой флуоресцентный белок. Это то же самое зацикленное видео, которое я показывал вам до этого, но я хочу продемонстрировать трехмерность наборов данных, которые мы собираем для получения таких видео.Мы фокусируемся на определенной плоскости и делаем снимок, затем смещаем фокус чуть глубже и делаем следующий снимок, и так далее. Для данного видео мы захватили объем глубиной около 60 microns, повторяя серию снимков этого объема примерно каждые 30 seconds, чтобы получить динамический объем. Данное видео снималось в течение примерно 20 minutes.Таким образом, мы можем отслеживать перемещение клеток в трех измерениях с течением времени. Мы только что продемонстрировали способ получения изображений тимуса с помощью двухфотонной микроскопии. Наиболее важными аспектами данной процедуры являются: во-первых, введение новорожденным костного мозга доноров.Во-вторых, препарирование тимуса без повреждения его структуры. В-третьих, надежное закрепление тимуса на покровном стекле для визуализации с помощью двухфотонного микроскопа. Визуализация тимуса позволяет ответить на многие вопросы о развитии тимоцитов и формировании разнообразного репертуара Т-клеток.На этом всё. Спасибо за просмотр и удачи в ваших экспериментах.

in-situ-imaging-of-the-mouse-thymus-using-2-photon-microscopy

Research

JoVE Journal

Biology

Биология

Двухфотонное изображений обнаружила лимфоцитов моторики и клеточных взаимодействий внутри лимфатических узлов под базальных условиях и во время иммунного ответа 1. Здесь мы демонстрируем приемных передачи Т-клеток, изоляция лимфатических узлов и изображений подвижность CD4 + Т-клеток в эксплантированных лимфатических узлов.

Разбор и 2-Фотон изображений периферических лимфатических узлов у мышей

Мы опишем метод неоднократно визуализации мышиной микроглии и циркулирующие...

Тонкие черепа Window Техника для Хронический Двухфотонное В естественных условиях Визуализация мышей микроглии в моделях Neuroinflammation

Мы разработали новые лабораторных инструментов и протоколов для прижизненного приобретения изображений тимуса. Наша методика должна помочь в выявлении «ниш» в тимус, где T развития клетка происходит.

Прижизненное Визуализация Мышь Thymus использованием 2-Фотон микроскопии

Покадровая визуализация у живого животного предоставляет ценную информацию о структурной реорганизации в интактном мозге. В данной работе мы представляем препарат для истонченного черепа, который позволяет транскраниально визуализировать флуоресцентно меченные синаптические структуры в коре головного мозга живой мыши с помощью двухфотонной микроскопии.

Двухфотонное<em&gt; В естественных условиях</em&gt; Визуализация дендритных шипиков в мыши Cortex Использование разреженных черепа Подготовка

Целью протокола является показать продольной прижизненной слежение в реальном времени тимоцитов, лазерной сканирующей микроскопии в тимуса имплантатов в передней камере глаза мыши. Прозрачность роговицы и васкуляризация трансплантат позволяет непрерывно записывать прогениторных клеток вербовки и зрелых Т-клеток выхода.

В режиме реального времени в Vivo отслеживания тимоцитов в передней камере глаза лазерная сканирующая микроскопия

В этом исследовании мы представляем протокол для анализа двух Фотон прижизненной изображений и ячеек взаимодействия в мышиных слизистой оболочки трахеи после заражения вирусом гриппа. Этот протокол будет актуален для исследователей, изучения динамики иммунных клеток во время инфекции дыхательных путей.

Изображений взаимодействия клеток в слизистой оболочки трахеи во время инфекции вируса гриппа с помощью двух Фотон прижизненной микроскопии

Морфологические изменения происходят в иммунных чувствительных фибробластных клетках после активации и способствуют изменениям в клеточной вербовке. Использование 2-фотонной визуализации в сочетании с генетически модифицированным фибробластным белком 1 (FSP1)-cre; tdTomato floxed-stop-floxed (TB/TB) линия мыши и зеленый флуоресцентно помеченный липополисахарид-FITC, мы можем проиллюстрировать весьма специфическое поглощение липополисахарида в дермальных фибробластах и морфологических изменениях...

В Vivo Двухцветные 2-фотон-изображения генетически-tagged репортер ателье клетки в коже

Настоящий протокол описывает интервенционную радиологическую процедуру, установленную для внутриутимической инъекции мышам, чтобы избежать риска открытой операции и повысить точность слепых чрескожных инъекций.

Минимально инвазивная, точная и эффективная методика интратермической инъекции мышам

В этой статье мы представляем протокол внутрижизненной визуализации трансплантированного левого легкого мыши с помощью двухфотонной микроскопии. Это представляет собой ценный инструмент для изучения клеточной динамики и взаимодействий в режиме реального времени после трансплантации легких мышей.

Прижизненная двухфотонная микроскопия пересаженного легкого мыши

Этот протокол содержит подробное описание пошагового подхода к модели мыши с хроническим окном черепа и микроваскулярной эмболии, оптимизированной для in vivo двухфотонной микроскопии с использованием флуоресцентных полистироловых микросфер.

Модель мыши для микроваскулярной эмболии для двухфотонной микроскопии in vivo с использованием флуоресцентных полистироловых микросфер

В данном исследовании представлен метод in vivo двухфотонной визуализации структуры концев аксонов низкопорогового механорецептора (LTMR) в коже передней лапы мышей. Используя повторяющуюся высококачественную визуализацию отдельных аксонов, этот метод предоставляет новую платформу для изучения структуры и функции кожной сенсорной цепи во время развития и у взрослых.

Интравитальная двухфотонная визуализация морфологии сенсорных аксонов при прикосновении в коже мыши

Изучите метод двухфотонной микроскопии для исследования миграции клеток в тимусе мыши. Этот протокол позволяет наблюдать динамику Т-клеток в реальном времени и изучать механизмы иммунологического развития.

Натурные съемки Мышь Thymus Использование 2-Фотон микроскопии

Больше видео