Одновременное выделение основных типов клеток резидентных клеток центральной нервной системы у взрослых мышей с аутоиммунным энцефаломиелитом
6 октября 2023 г.
На сегодняшний день протоколы одновременной изоляции всех основных типов резидентных клеток центральной нервной системы от одной и той же мыши являются неудовлетворенным спросом. В протоколе показана процедура, применимая у наивных и экспериментальных мышей с аутоиммунным энцефаломиелитом, для исследования сложных клеточных сетей во время нейровоспаления и одновременного снижения требуемой численности мышей.
Для исследования молекулярных и клеточных механизмов при аутоиммунных заболеваниях, таких как рассеянный склероз, создание воспроизводимых и сложных протоколов выделения клеток является неудовлетворенной потребностью. Большинство современных технологий выделения и анализа резидентных клеток ЦНС демонстрируют серьезные недостатки, такие как фокусировка только на одном типе клеток или только на постнатальных мышах. Существующий протокол одновременного выделения всех основных типов резидентных клеток ЦНС из одной репликации ЦНС дает возможность анализировать сложные нейронные сети и новые воспалительные пути ex vivo из одной клеточной суспензии, применимые к здоровым мышам и мышам с экспериментальным аутоиммунным энцефаломиелитом.
Наш протокол одновременного выделения всех четырех основных типов клеток ЦНС у здоровых мышей и мышей с ЭАЭ может быть использован в качестве полезного инструмента для исследовательских групп, изучающих новые воспалительные пути, что позволит гораздо точнее анализировать сложные биомолекулярные механизмы и клеточные сети ex vivo. Новые научные вопросы, на которые можно ответить с помощью нашего протокола, — это динамические исследования ЭАЭ на разных стадиях течения заболевания, таких как нейровоспаление, нейродегенерация и ремиссия. Кроме того, межклеточные взаимодействия и биохимические пути могут быть изучены на индивидуальном уровне.
Аналогичным образом, функциональные анализы могут быть выполнены с культивируемыми клетками. Мы намерены сосредоточиться на динамических исследованиях хода ЭАЭ для мультиомического анализа одного отдельного гомогената ЦНС в каждый момент времени ЭАЭ.
Обзор
В данном исследовании представлен новый протокол одновременного выделения всех основных типов резидентных клеток центральной нервной системы (ЦНС) из одной мыши, применимый как для контрольных групп, так и для моделей экспериментального аутоиммунного энцефаломиелита (ЭАЭ). Этот метод направлен на устранение ограничений современных технологий выделения клеток, позволяя исследователям изучать сложные клеточные взаимодействия при нейровоспалении, минимизируя при этом количество используемых мышей.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Нейробиология
- Клеточная биология
- Исследования аутоиммунитета
Теоретические сведения
- Существующие протоколы часто сосредоточены на одном типе клеток или только на постнатальных мышах.
- Изоляция резидентных клеток ЦНС может значительно углубить наше понимание нейровоспалительных процессов.
- Потребность в комплексном и воспроизводимом протоколе изоляции клеток становится все более актуальной в контексте изучения аутоиммунных заболеваний.
Цель исследования
- Разработать надежный протокол выделения всех основных типов резидентных клеток ЦНС из одной мыши.
- Облегчить анализ клеточных сетей в норме и при патологии.
- Обеспечить более точное изучение путей воспаления при нейровоспалении.
Используемые методы
- В исследовании используется метод диссоциации клеток, применимый как для здоровых мышей, так и для мышей с ЭАЭ.
- Мыши фиксируются в положении на спине; представлен подробный пошаговый протокол диссекции для получения тканей головного и спинного мозга.
- Тщательно описаны протоколы осаждения, промывки и очистки клеток, что обеспечивает высокий выход различных типов клеток ЦНС.
Основные результаты
- Данный протокол позволяет одновременно изолировать микроглию, олигодендроциты и другие резидентные типы клеток ЦНС для последующего анализа.
- Ожидается, что этот метод позволит получить представление о клеточной динамике на разных стадиях ЭАЭ.
- Ключевые улучшения включают сокращение количества используемых животных и повышение качества данных, полученных из препаратов ЦНС одной мыши.
Выводы
- В данном исследовании представлена новая методика изоляции клеток, которая расширяет возможности исследований в области нейроиммунологии.
- Способность данного метода анализировать сложные биомолекулярные механизмы при использовании меньшего количества образцов имеет важное значение для изучения моделей заболеваний ЦНС.
- В целом, данный протокол может помочь в поиске ответов на ключевые вопросы, касающиеся нейровоспаления и терапевтического вмешательства при аутоиммунных состояниях.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для промышленности
Одновременное выделение всех основных типов клеток ЦНС из взрослых мышей с ЭАЭ позволяет всесторонне исследовать механизмы нейровоспаления в рамках одного эксперимента. Данный подход обеспечивает возможность проведения многоомных анализов с высоким содержанием данных при одновременном сокращении количества используемых животных, что напрямую влияет на ранние этапы поиска и валидацию мишеней в портфелях нейроиммунологических исследований. Описанный протокол повышает прогностическую достоверность при снижении рисков, связанных с изучением сигнальных путей, и разработке трансляционных биомаркеров для моделей аутоиммунных заболеваний ЦНС.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Первичный поиск и валидация мишени
- Позволяет проводить ex vivo анализ сложных нейрональных и глиальных сетей из индивидуальных образцов ЦНС.
- Обеспечивает снижение механистических рисков за счет возможности динамического исследования стадий нейровоспаления, нейродегенерации и ремиссии.
- Способствует функциональной валидации мишеней путем выделения жизнеспособных высокоочищенных популяций клеток ЦНС.
- Снижает биологическую вариабельность за счет получения всех типов клеток от одного животного.
Скрининг и разработка анализа
- Обеспечивает получение валидированных суспензий одиночных клеток с высокой жизнеспособностью для последующего функционального и фенотипического анализа.
- Стандартизирует изоляцию различных типов клеток ЦНС, повышая воспроизводимость и сопоставимость результатов анализа.
- Позволяет масштабировать подготовку резидентных клеток ЦНС для скрининга соединений и изучения сигнальных путей.
- Поддерживает количественную оценку чистоты и жизнеспособности методом проточной цитометрии для подтверждения готовности образцов к анализу.
Трансляционные и доклинические исследования
- Соответствует релевантным моделям ЭАЭ для трансляционного поиска и валидации биомаркеров.
- Обеспечивает непрерывность процесса от этапа поиска до доклинической валидации за счет возможности многостадийного анализа заболевания.
- Способствует принятию обоснованных решений по продвижению исследований с учетом рисков, предоставляя исчерпывающие клеточные данные от отдельных животных.
- Поддерживает изучение межклеточных взаимодействий и биохимических путей, имеющих значение для аутоиммунитета ЦНС человека.
Интеграция конвейеров и рабочих процессов
Данный протокол интегрируется в континуум от этапа открытия до доклинических исследований, позволяя проводить одновременный анализ нескольких типов клеток от мышей с ЭАЭ и здоровых мышей, что поддерживает как гипотетически обоснованные, так и поисковые исследования.
- Открывающая биология: способствует проверке гипотез и уточнению сигнальных путей, обеспечивая возможность динамического анализа клеток ЦНС на конкретных стадиях.
- Скрининг: позволяет получать воспроизводимые суспензии клеток высокой чистоты для надежной разработки анализов и оценки соединений.
- Аналитика: предоставляет количественные показатели жизнеспособности и чистоты с помощью проточной цитометрии для сравнения различных условий.
- Трансляционные исследования: связывает этап открытий с доклиническими фазами, поддерживая согласование биомаркеров в моделях, релевантных конкретным заболеваниям.
- Корпоративное повторное использование: создает универсальную платформу для изоляции клеток ЦНС, применимую в различных исследовательских программах по нейровоспалению.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: повышает точность прогнозов и снижает неопределенность механизмов в исследованиях аутоиммунных заболеваний ЦНС.
- Практическая ценность: стандартизирует изоляцию клеток, повышает воспроизводимость и минимизирует количество используемых животных.
- Стратегическая ценность: оптимизирует принятие решений о целесообразности дальнейшей разработки (go/no-go) и эффективность использования капитала за счет возможности проведения многопараметрического анализа образцов от одного животного.
- Влияние на портфель: поддерживает приоритезацию с учетом рисков и продвижение мишеней и биомаркеров нейровоспаления.
Особенности реализации
- Требуется опыт в диссекции ЦНС, диссоциации клеток и магнитном сепарации клеток (MACS).
- Необходим доступ к приборам для проточной цитометрии и сортировки клеток для контроля качества.
- Требуется межкомандная стандартизация протоколов обработки тканей и анализа.
- Метод применим как для моделей ЭАЭ, так и для здоровых взрослых мышей для широкого использования.
- Результат зависит от тщательного обращения с материалом для поддержания жизнеспособности и чистоты клеток, что подтверждается исходными данными.
Часто задаваемые вопросы по биофармацевтике
Chapters in this video
0:00
Introduction
1:58
Preparation of CNS Tissue for Isolating Cells in EAE Mice
3:54
Dissociation of CNS Tissue for Isolating Cells in EAE Mice
5:25
Removal of Debris and Red Blood Cells from CNS Cell Suspension of EAE Mice
7:18
Isolation of CNS Cell Types Using Magnetic Beads in Naive and EAE Mice
