Эффективное обнаружение популяционных клеток боковой стороны Хёхста с помощью проточной цитометрии
23 августа 2024 г.
В данной работе мы показываем, что мощные лазеры с длиной волны 375 нм и 405 нм могут эффективно возбуждать Hoechst 33342 и служить жизнеспособной альтернативой лазеру с длиной волны 355 нм для обнаружения клеток боковой популяции (SP), тем самым расширяя диапазон доступных лазеров в приложениях проточной цитометрии.
Мы используем популяционный метод окрашивания Хёхста для обнаружения клеток, инициирующих опухоль. В этой статье мы попытаемся найти альтернативные подходы к возбуждению по методу Хёхста. Мы обнаружили, что мощные лазеры 375 и 405 нм могут служить реальной альтернативой традиционному 355-миллиметровому лазеру.
Обычно краситель Хёхста возбуждается ультрафиолетовым лазером на 355 нанометрах. Из-за высокой стоимости УФ-лазеров они обычно не используются в большинстве моделей проточной цитометрии. Наш протокол расширяет диапазон лазеров, которые могут быть использованы для обнаружения окрашивания по методу Хёхста.
Для исследователей, специализирующихся на нормальных и злокачественных стволовых клетках, можно использовать больше моделей проточной цитометрии для обнаружения цитопопуляционных клеток.
Обзор
В данном исследовании изучаются альтернативные методы возбуждения красителя Hoechst 33342, используемого для детекции опухолевых стволовых клеток. Мы демонстрируем, что высокомощные лазеры с длиной волны 375 nm и 405 nm могут эффективно заменить традиционный лазер 355 nm, расширяя возможности применения проточной цитометрии.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Проточная цитометрия
- Детекция клеток
- Методы лазерного возбуждения
Теоретические основы
- Hoechst 33342 обычно используется для идентификации клеток боковой популяции (SP).
- Традиционное возбуждение осуществляется с помощью УФ-лазера с длиной волны 355 nm, что является дорогостоящим методом.
- Существует потребность в более доступных вариантах лазеров для проточной цитометрии.
- В данном исследовании изучается эффективность альтернативных длин волн лазерного излучения.
Цель исследования
- Определение подходящих альтернативных лазеров для возбуждения красителя Hoechst.
- Повышение доступности методов проточной цитометрии.
- Улучшение детектирования опухолевых стволовых клеток.
Используемые методы
- Сравнение возбуждения красителя Hoechst при использовании лазеров с длиной волны 375 нм и 405 нм.
- Оценка эффективности детектирования в проточной цитометрии.
- Оценка экономической эффективности альтернативных лазеров.
- Внедрение протоколов для детектирования SP-клеток.
Основные результаты
- Лазеры с длиной волны 375 нм и 405 нм эффективно возбуждают Hoechst 33342.
- Эти лазеры являются жизнеспособной альтернативой лазеру с длиной волны 355 нм.
- Расширенный выбор лазеров может улучшить возможности детектирования SP-клеток.
- Предлагаются экономически эффективные решения для приложений проточной цитометрии.
Выводы
- Для возбуждения Hoechst подходят мощные лазеры с длиной волны 375 нм и 405 нм.
- Эти альтернативы могут повысить доступность метода в исследовательских условиях.
- В будущих исследованиях может быть изучено дальнейшее применение этих лазеров для детектирования клеток.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для отрасли
Надежное детектирование клеток боковой популяции (SP-клеток) с помощью окрашивания Hoechst 33342 имеет решающее значение для исследований стволовых и раковых стволовых клеток на этапах раннего поиска и в трансляционных конвейерах. Возможность использования мощных лазеров с длиной волны 375 нм или 405 нм вместо традиционных УФ-лазеров с длиной волны 355 нм расширяет доступ к валидированным методам анализа SP-клеток на большем количестве платформ проточной цитометрии. Такая гибкость улучшает валидацию мишеней в масштабе всего портфеля и снижает механистические риски как для программ по изучению нормальных, так и злокачественных стволовых клеток.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Ранние этапы поиска и валидация мишени
- Обеспечивает надежную идентификацию SP-клеток для функциональной валидации мишеней в исследованиях стволовых клеток и онкологии.
- Способствует механистическому снижению рисков путем подтверждения свойств вымывания красителя, связанных с активностью ABC-транспортеров.
- Повышает прогностическую достоверность анализов популяций стволовых клеток для сортировки портфеля исследований.
Скрининг и разработка анализа
- Подготовка валидированных систем детекции SP-клеток для последующих рабочих процессов скрининга соединений.
- Повышение воспроизводимости и стандартизации анализа за счет расширения спектра совместимого оборудования.
- Обеспечение масштабируемости и переносимости методов анализа SP-клеток между различными моделями проточных цитометров.
Трансляционные и доклинические исследования
- Обеспечивает согласованность детектирования SP-клеток с моделями, релевантными конкретным заболеваниям, для трансляционных исследований биомаркеров.
- Поддерживает непрерывность процесса от этапа первичного поиска до доклинической валидации мишеней, связанных со стволовыми клетками.
- Снижает риск возникновения технических затруднений при проведении многоцентровых исследований или исследований с использованием различных приборов.
Интеграция в конвейер и рабочий процесс
Этот метод интегрируется в континуум от поиска мишени до доклинических исследований, обеспечивая возможность детектирования SP-клеток на более широком спектре проточных цитометров, что способствует как ранней валидации мишени, так и трансляционным исследованиям.
- Открывающая биология: обеспечивает надежную платформу для проверки гипотез и уточнения сигнальных путей в биологии стволовых клеток и рака.
- Скрининг: предоставляет стандартизированные, воспроизводимые результаты анализа SP-клеток для оценки соединений.
- Аналитика: генерирует количественные данные флуоресценции для сравнительного анализа популяций клеток.
- Трансляционные исследования: обеспечивает согласованность биомаркеров и техническую непрерывность на разных этапах исследований.
- Корпоративное повторное использование: создает возможность многократного использования гибкого в выборе инструментов метода детекции SP-клеток для различных групп НИОКР.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: повышает прогностическую достоверность и снижает механистическую неопределенность в анализах стволовых клеток.
- Операционная ценность: улучшает стандартизацию, воспроизводимость и масштабируемость рабочих процессов детекции клеток SP.
- Стратегическая ценность: способствует принятию более обоснованных решений о продолжении или прекращении исследований (go/no-go) и повышает эффективность использования капитала за счет минимизации технических ограничений.
- Влияние на портфель: позволяет осуществлять приоритизацию с учетом рисков и продвигать программы в области стволовых клеток и онкологии.
Особенности реализации
- Требуется опыт работы с проточной цитометрией и стратегиями гейтирования SP-клеток.
- Необходим доступ к лазерам высокой мощности с длиной волны 375 нм или 405 нм и соответствующей аналитической инфраструктуре.
- Требуется межкомандная стандартизация протоколов гейтирования и регистрации флуоресценции.
- Может потребоваться адаптация для различных типов клеток или модельных систем.
- Совместимость приборов и мощность лазера должны быть проверены для каждой платформы.
Часто задаваемые вопросы по биофармацевтике
Chapters in this video
0:00
Introduction
1:14
Staining Mouse Bone Marrow Cells with Hoechst to Detect Side Population Cells by Flow Cytometry
2:22
Flow Cytometry of Hoechst‐Stained Mouse Bone Marrow Cells for Effective Detection of Side Population Using High‐Power 375 nm and 405 nm Lasers
