Выделение на основе проточной цитометрии и терапевтическая оценка инфильтрирующих опухоль лимфоцитов на мышиной модели рака поджелудочной железы

Мы сосредоточились на разработке метода выделения и адоптивного переноса инфильтрирующих опухоль лимфоцитов, TILs, в модели рака поджелудочной железы. Мы пытаемся ответить, могут ли подмножества TILs эффективно нацеливаться на опухоли поджелудочной железы in vivo и убивать их, и как Т-клетки могут быть оптимизированы для будущих клинических испытаний. Последние разработки в области адоптивной клеточной терапии, включая улучшение методов выделения и экспрессии TIL, мягкую модификацию TILs для улучшения их таргетирования, а также сочетание терапии TIL с другими иммунотерапическими препаратами, такими как ингибиторы контрольных точек или таргетная терапия для повышения противоопухолевой эффективности.

Мы разработали надежный метод выделения и расширения опухолеактивных TILs из мышиной модели рака поджелудочной железы. Мы продемонстрировали повышенную противоопухолевую эффективность адопциально перенесенных опухолевых Т-клеток. Наш протокол предлагает более целенаправленный подход к адоптивной клеточной терапии, позволяя выделять и выбирать опухолеспецифичные TILs по сравнению с другими, менее специфичными методами.

Он также использует биолюминесцентную визуализацию для неинвазивного мониторинга опухолей. Наши результаты позволят продвинуться в этой области, предоставив стандартизированную доклиническую модель для оценки эффективности терапии TIL и оптимизации параметров лечения субпопуляций Т-клеток при раке поджелудочной железы. Чтобы приготовить клеточную суспензию КПК-люциферазы для индукции ортотопической опухоли поджелудочной железы у мышей, трипсинизируйте клеточную линию КПК-люциферазы в течение одной минуты при температуре 37 градусов Цельсия.

После трипсинизации добавить PBS, перенести клетки, а затем центрифугировать клеточную суспензию. Подсчитайте клетки и ресуспендируйте их в концентрации 1 умножить на 10 в степени 6 клеток на миллилитр в PBS, содержащем 30% матрицы базальной мембраны. Поместите мышь под наркозом на операционную платформу.

Сделав разрез левой брюшной полости от 0,5 до 1 сантиметра, удерживайте селезенку с помощью щипцов и обнажайте поджелудочную железу. После приготовления смеси клеток КПК-люциферазы и матрицы базальной мембраны введите 50 микролитров клеточной суспензии, содержащей 50 000 клеток, в поджелудочную железу с помощью иглы 29 калибра. Вернуть поджелудочную железу в брюшную полость.

Последовательно зашивайте брюшину и кожу. Дайте мыши восстановиться на теплом коврике до полного пробуждения. Через семь дней внутрибрюшинно введите мышке 60 микролитров раствора калийной соли D-люциферина для визуализации в реальном времени.

После анестезии поместите мышь в систему визуализации in vivo для обнаружения биолюминесценции. После визуализации извлеките мышь из системы и дайте ей естественным образом восстановиться после анестезии. Для начала поместите донорскую усыпленную мышь на операционную платформу.

Простерилизуйте весь организм с помощью 75% этанола. В стерильном капюшоне используйте ножницы и щипцы для вскрытия брюшной полости. Удалите опухоль и поместите ее в PBS на лед.

Измерьте размер опухоли с помощью калибра Нониус. Затем рассчитайте объем опухоли с помощью формулы на экране. После приготовления раствора для разложения 1X с использованием коллагеназы, диспазы II и ДНКазы I в RPMI 1640 добавьте от одного до двух миллилитров раствора на лунку в 12-луночном планшете.

Измельчите новообразования на мелкие кусочки с помощью ножниц. Перенесите кусочки опухоли в каждую лунку 12-луночного планшета и переварите их при температуре 37 градусов Цельсия, встряхивая при 70 оборотах в минуту в течение 30 минут. Чтобы прекратить пищеварение, добавьте один-два миллилитра 10% фетальной бычьей сыворотки и переложите клеточную суспензию в пробирку для сбора.

Дважды промойте лунки 12-луночного планшета PBS, чтобы собрать оставшиеся клетки. Отфильтруйте клеточную суспензию через клеточный фильтр 70 микрометров, измельчите и измельчите фрагменты ткани, чтобы освободить отдельные клетки, используя плоский конец поршня шприца. Центрифугируйте фильтрат при 400 G в течение пяти минут при четырех градусах Цельсия и ресуспендируйте гранулу в 5% бычьем сывороточном альбумине для окрашивания проточной цитометрией.

Для начала поместите клетки, выделенные от мыши, несущей опухоль, вместе с селезенкой или мононуклеарными клетками периферической крови мыши без опухоли на рабочую платформу. Окрашивайте клетки блокаторами ФК и антителами потока в разведении от 1 до 100. Инкубируйте трубки на льду в темноте в течение 30 минут.

После инкубации клетки дважды промыть в PBS центрифугированием, прежде чем повторно суспендировать их в 1% бычьем сывороточном альбумине в PBS. На проточном цитометре для сортировки CD45+CD3+клеток затворить живые клетки на основе FSC-A и SSC-A для создания затвора P1. Затем забираем одиночные ячейки из P1 на основе FSC-A и FSC-H для создания вентиля P2. Отсортируйте CD45+CD3+клетки из P2 с помощью CD45 и CD3-гейтинга. Соберите отсортированные клетки в пробирки для сбора.

Центрифуга сортировала CD45+CD3+клетки при 400 G в течение пяти минут при четырех градусах Цельсия. Ресуспендируйте клетки в сыворотке мышей в концентрации 1 ум на 10 в степени 6 клеток на миллилитр, и поместите их на лед. Поместите мышь-реципиента, вызванную опухолью, на операционную платформу.

Используя инсулиновый шприц 29-го калибра 1/2 дюйма, внутрибрюшинно вводите отсортированные иммунные клетки. Затем вводите интерлейкин-2 внутрибрюшинно в течение трех дней подряд.