Быстрое и специфичное выявление инфекций Acinetobacter baumannii с помощью системы амплификации рекомбиназной полимеразы/Cas12A

Мои исследования сосредоточены на респираторных заболеваниях и инфекциях. Я расскажу о современных технологиях, которые развиваются в этой области, и о пробелах в исследованиях всей проектной области. Ключевые технологии, о которых мы здесь говорим, включают секвенирование нового поколения, CRISPR, секвенирование РНК одиночных клеток и модели анализа органов. Они жестко относятся к диагностике по стандартным заболеваниям сердца и предлагают более качественное лечение. Мой протокол направлен на удовлетворение потребности в быстром и специфическом обнаружении Acinetobacter baumannii, преодолевая ограничения в текущих диагностических вопросах, таких как трудоемкие и основанные на культуре методы.

[Рассказчик] Для начала спроектируйте 12 пар грунтовок с помощью инструментов проектирования грунтовок на основе стандартных принципов проектирования. Возьмите четыре прямых праймера и три обратных праймера, чтобы составить 12 пар праймеров. Оцените специфичность и эффективность каждой пары праймеров с помощью инструмента Primer-BLAST от Национального центра биотехнологической информации. Затем спроектируйте CRISPR РНК или направляющую РНК или гРНК, используя последовательность каркаса РНК LbaCas12a CRISPR в качестве фиксированной последовательности. Включите сегмент, специфичный для мишени, гарантируя, что протоспейсерный соседний мотив или PAM расположен на пятом простом конце некомплементарной цепи. Для создания положительной рекомбинантной плазмиды сначала амплифицируйте сегмент рДНК Acinetobacter baumannii 16S с помощью прямого и обратного наборов праймеров. Приготовьте смесь для ПЦР-реакции объемом 50 микролитров, как указано на экране. Установите условия цикличности ПЦР на ПЦР-аппарате. После очистки положительного результата ПЦР клонируйте его в вектор PUC57, который был расщеплен ферментами BamHI и SalI. Разбавляйте положительную рекомбинантную плазмиду последовательно с шагом в десять раз стерилизованной водой двойной дистилляции. Храните разведенную плазмиду при температуре минус 20 градусов Цельсия для дальнейших экспериментов. Затем смешайте регидратационный буфер без праймера, прямой и обратный праймеры A. baumannii и дважды дистиллированную воду до конечного объема 465 микролитров. Сделайте вихрь и кратковременно раскрутите смесь перед тем, как перенести ее в ферментные реакционные пробирки из набора RPA. Тщательно перемешайте и добавьте 25 микролитров 280 миллимолярного ацетата магния. Далее пипеткой пипетируют один микролитр положительной рекомбинантной плазмиды, содержащей 10⁷ копий на микролитр, в раствор А с различными парами праймеров. Инкубируйте раствор при температуре 39 градусов Цельсия в течение 20 минут. Затем очистите амплифицированные продукты с помощью набора для очистки RPA. Запустите очищенное средство на 1% агарозный гель при напряжении 120 вольт в течение 10 минут, чтобы определить пару праймеров с самой яркой и широкой полосой. Для оптимизации системы амплификации RPA необходимо поддерживать концентрацию всех остальных компонентов реакции на постоянном уровне, регулируя конечный объем раствора А до 465 микролитров. Затем добавьте соответствующие объемы не содержащей РНК воды двойной дистилляции для получения окончательных концентраций праймера в заданном виде и инкубируйте. После очистки и электрофорирования продукта RPA определите оптимальную концентрацию праймера и время инкубации путем анализа интенсивности и распределения полосы. Чтобы приготовить раствор В, смешайте одноцепочечный репортер ДНК, реакционный буфер CAST12a, CRISPR RNA CAST12a и дважды дистиллированную воду до конечного объема 15 микролитров. Добавьте пять микролитров рекомбиназной полимеразы амплификации или продукта RPA в раствор В. Тщательно перемешайте до однородности. Поместите образцы в флуоресцентный инструмент для количественной ПЦР. Для проверки специфичности получите матрицы ДНК различных видов с помощью набора для извлечения ДНК или путем кипячения бактерий в воде. Используйте воду в качестве отрицательного контроля. Перенесите 10 нанограммов, или один микролитр, матриц ДНК в раствор А, содержащий прямые и обратные праймеры. Затем пипетка 25 микролитров 280 миллимолярного ацетата магния. Тщательно перемешайте и выдерживайте при температуре 39 градусов Цельсия в течение 20 минут. После инкубации добавьте пять микролитров продукта реакции в раствор В и перемешайте. Поместите образцы в инструмент для флуоресцентной количественной ПЦР. Установите канал на FAM и считывайте флуоресцентный сигнал каждую минуту при температуре 39 градусов Цельсия в течение 60 минут. Для оценки чувствительности детектирующей платформы на основе RPA-CRISPR CAST12a в качестве матрицы для реакции используется положительная рекомбинантная плазмида, разведенная до концентраций от одной до 10⁷ копий на микролитр. Используйте воду в качестве отрицательного контроля. Перенесите плазмиду в раствор А, добавьте ацетат магния и инкубируйте, как показано ранее. После инкубации и переноса в раствор В считайте флуоресцентный знакАль. Праймерная пара F3-R3 была определена как наиболее эффективная для амплификации рекомбиназной полимеразы, демонстрируя наиболее яркие и плотные полосы на электрофорезе в агарозном геле. Оптимальная концентрация праймера для амплификации была определена равной 0,44 микромоляра, а оптимальное время реакции – 20 минут. Интенсивность флуоресценции CRISPR RNA1 со временем увеличивалась, в то время как CRISPR RNA2 не увеличивалась, что привело к выбору CRISPR RNA1 для обнаружения A. baumannii. Анализ специфичности подтвердил, что детекторная система A. baumannii обнаруживает исключительно ДНК A. baumannii, а для других образцов бактериальной ДНК флуоресценция не наблюдается. Система может обнаруживать всего одну копию на микролитр ДНК, что делает ее очень чувствительной. Полосковый анализ бокового потока подтвердил высокую специфичность метода обнаружения, не показав перекрестной реактивности с другими видами бактерий. Анализ A. baumannii успешно обнаружил ДНК в разведениях от 10⁷ копий на микролитр до одной копии на микролитр, подтвердив ее устойчивость к ультрафиолетовому излучению.