Сердечная микрофизиологическая система для изучения размножения Ca²⁺ с помощью негенетической оптической стимуляции

Исследование направлено на совершенствование микрофизиологических моделей сердца in vitro за счет интеграции методов фотостимуляции на основе материалов. Он направлен на преодоление ограничений в продолжительности жизни и инвазивности стимуляции, предоставление надежных инструментов для изучения физиологии сердца, улучшение процессов скрининга лекарств и содействие применению в моделировании заболеваний. Последние достижения в области биостимуляции, например, для точного неинвазивного клеточного контроля.

Оптогенетика позволяет генетически модифицировать клетки для регулирования клеточной активности, в то время как новые фотопреобразователи на основе материалов предлагают негенетические альтернативы. Эта инновация обеспечивает значительный прорыв в изучении и модуляции нейронов, кардиомиоцитов и скелетных мышечных клеток в различных приложениях. Текущие экспериментальные задачи включают в себя достижение стабильной доставки света в глубокие ткани, оптимизацию биосовместимости и стабильности фотопреобразователей, а также повышение точности методов световой стимуляции.

Кроме того, интеграция этих методов со сложными биологическими системами при сохранении жизнеспособности и функциональности клеток остается ключевым препятствием. Этот протокол устраняет пробел в исследованиях, связанный с потребностью в неинвазивных методах точной стимуляции в сердечных микрофизиологических моделях. Используя фотопреобразователи на основе материалов, такие как Ziapin2, этот подход преодолевает ограничения традиционной электростимуляции и оптогенетики, предлагая улучшенный временной и пространственный контур при сохранении жизнеспособности и функции тканей.

Мои результаты будут способствовать продвижению исследований за счет внедрения неинвазивной техники световой стимуляции на основе материалов, которая обеспечивает большую точность и контроль над клеточной активностью в сердечных тканях. Такой подход устраняет необходимость в генетических модификациях, предоставляя универсальный инструмент для моделирования функции сердца, изучения механизмов заболевания и разработки более эффективных терапевтических стратегий. Для начала приклейте два слоя лабораторной ленты, один белый и один синий, на прозрачный, устойчивый к царапинам и ультрафиолетовому акрилу толщиной в один миллиметр.

Вырежьте на ленте узор из стружки в соответствии с задуманным дизайном, затем с помощью лазерного гравера на углекислом газе разрежьте акриловый лист на круги. Удалите два слоя ленты внутри самой внутренней линии с помощью пинцета. Замочите чипсы в чистом отбеливателе на срок от 30 минут до одного часа, чтобы удалить толстые линии и темные пятна от разреза, оставив острую линию, и промойте чипсы в стакане проточной деионизированной водой на ночь или не менее трех часов.

Обработайте микросхемы ультразвуком в течение 10 минут в полидиметилсилоксане или штампах PDMS с элементами линейных канавок в течение 30 минут в чистом 70% этаноле. Перенесите сколы и штампы в чистое место под капотом и дайте им высохнуть под воздействием воздуха в течение примерно одного-двух часов. Затем обработайте свежеприготовленный желатин ультразвуком в течение 15 минут, затем верните его на водяную баню при температуре 65 градусов Цельсия до готовности к использованию.

Поместите микробную трансглютаминазу или трубку MTG в эксикатор со слегка ослабленной крышкой и медленно включите вакуум, чтобы удалить пузырьки. После дегазации верните трубку MTG на водяную баню с температурой 37 градусов Цельсия. Затем накройте лист сетки чистой парапленкой и поместите стружку на сетку.

Держите марку PDMS поблизости для использования. Добавьте пять миллилитров MTG к пяти миллилитрам желатинового раствора, тщательно пипетируя, чтобы избежать образования пузырьков. Теперь быстро нанесите примерно 0,5 миллилитра желатиновой смеси на каждую чипсу, следя за тем, чтобы смесь покрывала область чипса.

Поместите сверху штамп PDMS с линейным рисунком и приложите груз весом 200 граммов, чтобы желатин располагался параллельно продольной оси ткани. После того, как все чипсы будут сформированы, накройте их стеклянной банкой, чтобы избежать воздействия окружающей среды, и дайте им сшиться в течение ночи. Перенесите чип и штамп PDMS в новую чашку P150, наполненную PBS, чтобы гидратировать желатин в течение от 30 минут до одного часа, чтобы облегчить отделение штампа PDMS от чипа.

После удаления излишков желатина вокруг чипса переложите чистую стружку в новую чашку P150, наполненную PBS. Храните марки PDMS в 70% этаноле. Чтобы простерилизовать чипсы, замочите их в этаноле на 10 минут под колпаком.

Переложите чипсы в PBS, замочите их на 10 минут, после чего трижды промойте PBS. Для покрытий смешивают 20 мкг на миллилитр фибронектина с разбавлением Geltrex в питательных средах без добавки в соотношении 1 к 100. Обмазывайте этим раствором чипсы в течение двух часов в инкубаторе при температуре 37 градусов Цельсия и 5% углекислого газа.

Размораживание и посев индуцированных человеком плюрипотентных кардиомиоцитов, полученных из стволовых клеток, в среде RPMI, содержащей 10 микромоляров Y-27632. Замените носитель на RPMI без Y-27632 через 24 часа. Через три дня после посева клеток с помощью пинцета аккуратно удалите белую ленту со сколов.

Подготовить аппаратуру для оптического картирования, состоящую из модифицированного тандемного линзового микроскопа, оснащенного высокоскоростной камерой и ртутной лампой мощностью 200 милливатт в качестве источника возбуждающего света. Поместите дихроичное зеркало перед предназначенной для этого камерой с кальциевым изображением. Для оптической стимуляции применяйте оптическую точечную стимуляцию на одном конце ткани с помощью светодиодного источника света для стимуляции фотопреобразователя Ziapin2.

Перемещайте ткани с частотой 0,5 или одного герца с помощью регулируемого по времени оптического волокна, расположенного на расстоянии одного миллиметра от ткани. Инкубируйте образец с добавлением двух микромоляров X-Rhod-1 в питательную среду в течение 30 минут при температуре 37 градусов Цельсия. После промывки чипсов свежей питательной средой переложите их в феноловую среду без красных RPMI 1640, дополненную В-27 минус инсулином и HEPES.

Поместите чипы тканей в чашку с регулируемой температурой, установленной на физиологическую температуру, и начните запись с частотой кадров 2,5 кадра в секунду. Распространение кальциевой волны было успешно визуализировано с четким пространственным и временным разрешением во время фотостимуляции на частотах 0,5 или 1 герц, со скоростями проводимости, рассчитанными примерно 4,5 сантиметра в секунду, что соответствует физиологическим значениям. Переходные параметры кальция, включая амплитуду, время нарастания, максимальный затухание, наклон и время затухания, были количественно схожими между световой и электрической стимуляцией, что подтверждает сопоставимые функциональные реакции.