Анализ субпопуляций тромбоцитов с помощью многоцветной проточной цитометрии

В нашем исследовании используется многоцветная проточная цитометрия для идентификации и характеристики субпопуляций тромбоцитов с целью понять роли, паттерны активации и клиническую значимость в контексте тромбоза, воспаления и конкретного заболевания. Установленный многоцветный проточный цитометрический анализ позволил наблюдать , агонист тромбоцитов индуцирует отчетливый паттерн активации и по сравнению с коллагеновым родственным пептидом генерирует прокоагулянт и субпопуляции. Многоцветный анализ позволяет одновременно измерять активацию тромбоцитов, адгезию, агрегацию и апоптотический потенциал одного тромбоцита в популяции изолированных тромбоцитов человека в одной пробирке.

[Инструктор] Для начала подготовьте все реактивы, необходимые для проведения процедуры. Теперь смешайте 10 миллилитров 10-кратного буфера Tyrode's с 90 миллилитрами дистиллированной воды. Добавьте 0,1 грамма глюкозы и отрегулируйте pH полного объема с помощью hepes до 7,4. Сначала установите pH 10 миллилитров буфера на 7,4, а затем отрегулируйте pH оставшихся 90 миллилитров с одной обычной соляной кислотой до 6,5. Для забора образца крови подготовьте для каждого донора шприц объемом 10 миллилитров с двумя миллилитрами антикоагулянта ACD. Дайте шприцу отбалансироваться при комнатной температуре. После сбора донорской крови в предварительно нагретый шприц ACD медленно перенесите обработанную ACD кровь в реакционную пробирку объемом 15 миллилитров. Центрифугируйте обработанную кровь ACD при температуре 209G в течение 20 минут при комнатной температуре, не используя перерыв. Тем временем приготовьте 25 миллилитров буфера Tyrode's Hepes с pH 6,5 в реакционной пробирке объемом 50 миллилитров. После центрифугирования аккуратно перенесите верхний слой обогащенной тромбоцитами плазмы в пробирку, содержащую буфер Hepes Tyrode. Чтобы предотвратить загрязнение, оставьте примерно один миллилитр обогащенной тромбоцитами плазмы над охристой шерстью и слоем эритроцитов. Затем центрифугируйте суспензию при 430G в течение 10 минут при комнатной температуре, чтобы гранулировать тромбоциты. Выбросьте надосадочную жидкость и осторожно ресуспендируйте тромбоцитарную гранулу в 200-300 микролитрах буфера Тайрода, доведенного до pH 7,4. Измерьте количество тромбоцитов с помощью клеточного счетчика, прежде чем регулировать его до 200 000 тромбоцитов на микролитр с помощью буфера Tyrode's Hepes при pH 7,4. Для рецепторов, которые не требуют активации перед окрашиванием, включая CD61, CD42B, CD41, CXCR7 и CXCR4, приготовьте один неокрашенный и один окрашенный образец для каждого антитела. Для рецепторов или маркеров, требующих активации, таких как PAC-1, CD63, CD62P, NXN5 и зомби-NIR. Активируйте образец 10 микрограммами на миллилитр CRPXL и подготовьте как активированные, так и неактивированные образцы. Чтобы активировать тромбоциты, инкубируйте их с 10 микрограммами на миллилитр CRPXL в течение 30 минут. Затем инкубируйте выделенный тромбоцит с различными концентрациями конъюгированного антитела флуорохрома или умрите в течение 30 минут. Затем добавьте 300 микролитров буфера, связывающего анексин, в каждый образец, чтобы разбавить его. Измерьте 10 000 событий для каждого образца с помощью проточного цитометра. Рассчитайте индекс окрашивания для каждого антитела, чтобы определить оптимальное разделение между положительными и отрицательными популяциями. Постройте график зависимости индекса окрашивания от концентрации антител, чтобы определить оптимальную концентрацию для каждого антитела Для окрашивания растворите порошок гемена в гидроксиде натрия 1,4M, чтобы получить раствор 3M. Нагрейте раствор до 96 градусов Цельсия в течение пяти минут со скоростью 450 оборотов в минуту. Разбавьте его дистиллированной водой до получения трехмиллимолярного раствора стебля. После корректировки количества тромбоцитов до 1 миллиона тромбоцитов на образец активируйте тромбоциты, как было показано ранее. Добавьте 43,3 микролитра коктейля антител в каждый образец и инкубируйте их в течение 30 минут при комнатной температуре в темноте. После инкубации разбавьте каждый образец 300 микролитрами одного X и X в связывающем буфере, состоящем из 10 миллимолярного гидроксида натрия Hepes при pH 7,4. Немедленно измерьте каждый окрашенный образец с помощью проточного цитометра. Для компенсации с помощью шариков приготовьте 150 микролитров PBS для каждого флуорофора и добавьте одну каплю гранул и один микролитр флуоресцентного конъюгированного антитела. Для компенсации аннексина V используйте семь шариков PECY7B, меченных античеловеческим CD 62L, конъюгированным с тем же флуорофором, что и аннексин V. Используйте аминоспособные компенсационные шарики для аминоспособного красителя, смешав две капли положительных шариков и одну каплю отрицательных шариков в 150 микролитрах PBS с одним микролитром кристалла. Убедитесь, что положительные бусины реагируют и подают сигнал, а отрицательные бусины — нет. Подготовьте флуоресценцию минус один контроль для каждого маркера. Диаграммы рассеяния показали явный сдвиг в популяции тромбоцитов. При этом гемин образует больше тромбоцитов с низким прямым разбросом, чем другие агонисты. Лечение тромбином АДФ и CRPXL привело к тому, что от 40 до 60% тромбоцитов были CD42-положительными, в то время как гемин значительно сократил эту популяцию. Все агонисты тромбоцитов не влияли на поверхностную экспрессию CD41 и CD61. Только hemen значительно увеличивал поверхностную экспрессию CXCR4 и CXCR7. Кроме того, экспозиция фосфатидилсерина также усиливалась при лечении гемином, что приводило к увеличению количества аннексин-V-положительных клеток. UMAP и анализ фенольных графов определил 27 различных кластеров тромбоцитов, которые варьировали в зависимости от типа агонистов. Хемин вызвал самый резкий сдвиг в кластерных структурах. Покоящиеся субпопуляции тромбоцитов были наиболее хорошо сохранены с помощью АДФ и арендованы с гемином.