In vivo Визуализация выявляет миграционное поведение лейкоцитов внутри суставов

Поскольку лейкоцитарные костные клетки происходят из костного мозга, они должны проникать в ткани для вызова воспаления. Контроль этого процесса является ключевым моментом, в котором можно разработать новые терапевтические средства для снижения воспаления. В целом трафик лейкоцитов в воспалённые ткани происходит в посткапиллярных венулах и следует за каскадом спайки, который начинается с захвата свободно текущего лейкоцита стенкой сосуда.

Затем следует перекат вдоль стенки сосуда в направлении pro. Остановка эндотелия. Таким образом, от склеяния и ползания во всех направлениях по поверхности сосуда, можно найти соответствующее место и трансэндотелиальную миграцию в определённое место внутри ткани.

Провоцирование воспалений. Эти отдельные этапы регулируются сочетанием молекулярных сигналов, включая хемоаттрактанты. Хемоаттрактант активирует лейкоциты через ZP Cs и играет важную роль в миграционном каскаде.

Таким образом, дополнительные конечные исследования и эксперименты in vitro не дали представления о том, как хемоаттрактант и хемоаттрактантный рецептор сигнализируют динамически регулируют миграционное поведение лейкоцитов in vivo. Таким образом, недавние достижения в технологиях визуализации предоставили беспрецедентные взгляды на миграцию иммунных клеток у живых животных, что значительно расширило наше понимание молекулярной регуляции трафика иммунных клеток in vivo. Поэтому недавно мы подали заявку на исследование молекулярного механизма, контролирующего трафик нейтрофилов к местам воспаления суставов.

Итак, наша invivo суставная визуализация создаёт новую парадигму реакций гиперчувствительности типа III внутри сустава. Таким образом, компонент комплемента C5a выступает инициатором воспаления, а клетки, проживающие в тканях, играют более значимую роль в воспалении в нынешней парадигме реакций гиперчувствительности типа III. Таким образом, in-vivo визуализация сустава является ценным методом для выявления миграционного поведения лейкоцитов и молекулярной динамики с воспалённым суставом.

Поэтому мы делимся этим протоколом для in-vivo суставной визуализации, чтобы поддержать исследовательские группы, изучающие этот процесс в воспалённых суставах. Подготовьте разбавительный коллаген типа II в 0,05 молярной уксусной кислоты, встряхивая ночью при 4 градусах, чтобы получить разбавление эмульсионной смеси коллагена с полным адъювантом Фройнда в соотношении 1:2 в стеклянном шприце. Его также можно было смешивать вручную примерно 20 минут.

Этот процесс генерирует тепло, охлаждая стеклянный шприц с эмульсией на льду. Мыши, анестезированные перед прививками. Формируйте волосы вдоль хвоста с помощью машинки для машинки, чтобы подготовиться к прививке.

Медленно вводите 100 микролитров эмульсии в подкожное пространство у основания хвоста. Клиническая оценка артрита и измерение толщины лапы необходимы для оценки активности заболевания. Обычно клинические оценки по артриту и измерения толщины лапы проводятся каждые один-три дня после первых прививок.

Клинический балл артрита для этой оценки — это сумма баллов для всех четырёх лап каждой мыши. Баллы записываются следующим образом. Итак, ноль — это ненормально.

Одна — эритема и отёк одного пальца. Второй — эритема, отёк двух пальцев или эритема и отёк голеностопного сустава. Третий — это эритема и отёк более трёх пальцев или отёк двух пальцев и сустава голеностопа.

Четвёртый — эритема и сильная отёк голеностопа, стопы и пальца с деформацией. Таким образом, измерение толщины лапок измеряется с помощью цифровых затворных суппортов. Для каждой мыши используется средняя толщина лапы для всех четырёх лап.

Мышей обезболивают, а затем они формируют лапку с помощью машинок. Используйте крем для удаления оставшихся волос. Снимите крем влажной марлей.

Нанесите стерильную смазку для роговицы на оба глаза, чтобы предотвратить высыхание роговицы и снизить риск колебаний роговицы. Под хирургическим эндоскопом сделайте разрез длиной один сантиметр по коже с помощью микроножниц. Закройте ранние изображения с помощью 1,5% агарозы с помощью PBS.

Сцена задаётся на микроскопе. Отрегулируйте настройки конфокального микроскопа, включая мощность лазера, усиление, смещение и расположение. После того как найдено подходящее место, начинайте сбор изображений.

Репрезентативный результат ЦРУ. Обычно начало артрита наблюдается на 28-й день, при этом клинический балл и толщина лапы достигают пика на 35-й день. Частота ЦРУ у мышей DBA на 1 день обычно превышает 900–100% к 35-му дню.

Здесь слева показывается сустав в контроле мышей, а справа — сустав у мышей ЦРУ. В этих фильмах зелёные клетки представляют положительные нейтрофилы Ly6G. Оранжевые клетки указывают на положительные Т-клетки CD4, а белые участки соответствуют кровеносным сосудам.

На 35-й день видно, что вне кровеносных сосудов присутствует больше положительных Ly6G нейтрофилов по сравнению с CD4+T-клетками. Эти нейтрофилы сильно подвижны, активно движутся в различных направлениях внутри воспалённого сустава. Здесь я показываю репрезентативный анализ in-vivo съёмок суставов.

График слева показывает количество вновь прилипших нейтрофилов, а график справа — количество недавно перенесённых нейтрофилов во время 30-минутной записи. В артритных суставах количество как недавно прилипших, так и трансмигрированных нейтрофилов значительно выше, чем в контрольных суставах. В заключение мы представляем наш текущий протокол для in-vivo визуализации суставов, который позволяет в высоком разрешении, в реальном времени визуализировать миграционное поведение лейкоцитов у живых мышей в физиологических и патологических условиях.

Эта техника позволяет нам напрямую наблюдать, как иммунные клетки взаимодействуют внутри воспалённых тканей, как они прилипают к стенкам кровеносных сосудов, пересекаются в ткань и организуют воспалительные реакции. С помощью этого подхода мы можем зафиксировать динамические клеточные поведения, которые иначе невидимы с помощью традиционных гистологических или экстракорпоральных методов. Объединяя эту систему визуализации с количественным анализом и молекулярными маркерами, мы можем выявить ключевые пути, способствующие возникновению и прогрессированию артрита.

Важно, что полученные в результате этих invivo наблюдений не только углубляют наше понимание динамики иммунных клеток, но и служат научной основой для выявления новых терапевтических целей. По мере дальнейшего развития этой технологии и по мере того как всё больше исследователей адаптируют и совершенствуют методологию, мы считаем, что визуализация in vivo станет важной платформой для изучения сложных иммунно-опосредованных заболеваний и мощным разрывом, связывающим базовую иммунологию с трансляционными и клиническими исследованиями. В конечном итоге мы надеемся, что этот подход способствует разработке инновационных методов лечения ревматоидного артрита и других хронических воспалительных заболеваний в ближайшем будущем.