Мультиплексная иммунофлуоресцентная визуализация на основе штрих-кодов ДНК для анализа образцов FFPE из генетически перепрограммированной меланомы мышей

Мы представляем протокол разработки и валидации мультиплексной иммунофлуоресцентной панели для изучения тканей FFPE мышей и демонстрируем его полезность путем изучения образцов из модели меланомы, обработанных наночастицами, доставляющими плазменную ДНК, кодирующую иммунологические сигналы для перепрограммирования микроокружения опухоли. В этой области отсутствовали тщательно разработанные и валидированные протоколы мультиплексной иммунофлуоресценции, совместимые с мышиными фиксированными формалином парафинами тканями FFPE.

Встраивание парафина с фиксированным формалином сохраняет морфологию тканей в течение длительного времени, легко в обращении и хранении, а также позволяет создавать тканевые микрочипы для просмотра нескольких образцов на одном предметном стекле.

Пространственная протеомная визуализация улучшит визуализацию и анализ сложного опухолевого микроокружения, в конечном итоге способствуя прогнозированию иммунных реакций, что может способствовать разработке более эффективных методов лечения.

Мы будем использовать этот протокол для улучшения пространственного профилирования моделей опухолей мышей для гораздо большего числа типов опухолей и различных иммунных органов.

[Рассказчик] Для начала запекайте салфетки FFPE при температуре 60 градусов Цельсия на ночь. На следующий день горки охладить при комнатной температуре в течение 10 минут перед началом депарафинизации и регидратации. Затем инкубируйте предметные стекла в растворе ксилола дважды по пять минут каждый, чтобы удалить парафин, затем регидратируйте ткань, перемещая предметные стекла через 100% этанол дважды в течение пяти минут каждое. Поместите предметное стекло последовательно в 90%, 70%, 50% и 30% растворы этанола на пять минут каждое. Дважды промойте горки дистиллированной водой по пять минут каждая. Выполните забор антигена, затем используйте свежий отбеливающий раствор для отбеливания ткани дважды в течение 45-минутных интервалов перед выполнением окрашивания антителами. Затем проведите окрашивание антител в течение ночи при температуре четыре градуса Цельсия с помощью пластиковой камеры. После окрашивания снимите пластиковую камеру и соберите ранее нанесенный коктейль антител. Промойте предметные стекла два раза в буфере для окрашивания по две минуты каждый. Инкубируйте предметные стекла в банке для окрашивания, содержащей 40 миллилитров фиксирующего раствора после окрашивания, в течение 10 минут, затем промойте их PBS трижды по две минуты каждый. Теперь переложите предметные стекла в ледяной метанол на пять минут, прежде чем промыть PBS. Нанесите 200 микролитров окончательного фиксирующего раствора на каждое предметное стекло под камерой влажности. После 20-минутной инкубации при комнатной температуре снова промойте предметные стекла в PBS в течение трех циклов по две минуты каждый. При немедленной визуализации протрите предметное стекло вокруг ткани безворсовой салфеткой. Нажмите на проточную ячейку в течение 30 секунд с помощью оборудования для сборки проточной ячейки. Если визуализация выполняется позже, храните предметное стекло без применения проточной ячейки в буфере хранения при температуре четыре градуса Цельсия. Когда все будет готово к изображению, перенесите слайды из буфера хранения в PBS на 10 минут перед применением проточной ячейки. Затем подготовьте буферы для обкатки ДМСО на основе требуемых циклов визуализации. Подготовьте репортерное стоковое решение, необходимое для общего количества циклов визуализации. Пипетка 250 микролитров стокового раствора репортера и по пять микролитров каждого репортера в пробирки для микроцентрифуг с маркировкой черного или янтарного цвета объемом один миллилитров. Перелейте раствор на черную 96-луночную пластину и запечатайте ее клеевой фольгой. Теперь запустите устройство обработки изображений и используйте диспетчер инструментов для установки параметров и времени экспозиции. Поместите репортерную пластину в устройство, а затем поместите предметное стекло в держатель микроскопа, чтобы начать визуализацию. Получение изображений окрашенных тканей. Установите последнюю версию программного обеспечения для цифрового анализа патологий. Нажмите кнопку «Создать проект» и выберите папку назначения для пространства проекта. Затем нажмите «Добавить изображения», а затем «Выбрать файлы». Затем перейдите к файлу QuP TIFF, полученному с помощью мультиплексной иммунофлуоресцентной визуализации. Установите для параметра Тип изображения флуоресцентный, сохраните настройки по умолчанию и нажмите кнопку Импорт. Если вы используете QuPath, дважды щелкните новое изображение, чтобы открыть рабочее пространство, затем периодически нажимайте кнопку «Файл» и «Сохранить», чтобы отслеживать изменения в проекте. Переключайте параметры видимости и просмотра маркера с помощью инструмента «Яркость и контрастность» на панели инструментов. С помощью инструмента «Кисть» или «Палочка» нарисуйте аннотацию вокруг всего участка ткани. Определите эту аннотацию как полную ткань, исключив вышележащую кожу или участки, которые не следует анализировать. Удерживайте клавишу ALT для создания отрицательных аннотаций или сжатия границ. Теперь выберите аннотацию, щелкнув вкладку «Аннотации» и нажав «Объекты», а затем «Аннотации», затем нажмите «Дублировать выбранные аннотации». Включите канал SOX 10, затем сожмите дублирующуюся аннотацию, чтобы определить область опухоли с помощью инструмента ALT + кисть/палочка. Теперь выберите полную аннотацию ткани. Затем перейдите в раздел «Объекты», затем «Аннотации» и «Развернуть аннотации». Установите радиус расширения равным одному микрометру и нажмите «Выполнить». Переименуйте эту новую аннотацию в «Полное расширение тканей». Выберите аннотацию опухоли, щелкните правой кнопкой мыши и выберите команду Вставить в иерархию. Снова выберите аннотацию опухоли, затем перейдите в Объекты, Аннотации и нажмите Сделать инвертированной. Определите эту новую аннотацию как Stroma и повторите для всех участков ткани. Чтобы запустить сегментацию ячеек, нажмите на вкладку «Изображение», чтобы найти ширину и высоту изображения в пикселях. Скачайте расширение StarDist с GitHub. Импортируйте файл расширения QuPath StarDist.jar файл в QuPath. Также загрузите файлы скриптов StarDist groovy и файл модели с GitHub. Для каждого участка ткани выберите аннотации опухоли и стромы. На панели настроек нажмите «Автоматизировать», а затем «Редактор скриптов», чтобы открыть интерфейс скрипта. Откройте соответствующий скрипт сегментации ячеек StarDist в соответствии с размером пикселя изображения. При появлении запроса выберите StarDistcellsegmodel.pb для сегментации ячеек. После сегментации ячеек сохраните изображение, затем последовательно нажмите «Измерить», «Экспортировать измерения», выберите соответствующие изображения и установите тип экспорта как ячейки и разделитель как .csv. Выберите расположение выходного файла, затем нажмите «Заполнить», чтобы добавить соответствующие метрики. Для каждого маркера происхождения, который будет использоваться в кластеризации или фенотипировании, выберите одно среднее значение для экспорта. Для нормализации протеомных данных откройте экспортированный файл CSV и урежьте заголовки столбцов, чтобы сохранить только имя маркера. После установки последней версии R & R Studio загрузите скрипт нормализации маркеров .r с GitHub и запустите его для фильтрации ячеек на основе размера ядра. Выполните минимальную/максимальную нормализацию для каждого маркера. После завершения сохраните новый CSV-файл с нормализованными данными. Конъюгация штрих-кода ДНК антител была подтверждена с помощью электрофореза в белковом геле, который показал дополнительные полосы в области тяжелой цепи. Мультиплексная иммунофлуоресцентная визуализация боковых опухолей B16-F10, обработанных наночастицами 4-1BBL/IL-12 и системными анти-PD1, показала отчетливую экспрессию иммунных маркеров на всех срезах опухоли. Кластеризация FlowSOM выявила более широкий диапазон интенсивностей экспрессии маркеров по сравнению с фенотипированием Сёра, с максимальной разницей в интенсивности примерно 0,7 против 0,5. Фенотипирование FlowSOM также классифицировало большее количество макрофагов на подтипы M1 и M2. Количественная оценка плотности макрофагов показала, что FlowSOM обнаружил более высокую плотность макрофагов M1 и M2 по сравнению с Seurat, в то время как Seura классифицировал больше макрофагов как Other. Пространственный анализ показал, что М2-макрофаги и естественные киллеры имеют самые высокие средние минимальные расстояния после лечения, а М1-макрофаги более распространены вокруг CD8 Т-клеток.