В Ово Ксенотрансплантация клеток острого лимфобластного лейкоза (ОЛЛ) от пациента (PDX-ОЛЛ)

Предметом данного исследования является биология рака, с акцентом на определение терапевтических стратегий для лечения рака. Модель острого лимфобластного лейкоза, полученная от пациента с помощью ксенотрансплантата, ограничена относительно коротким экспериментальным окном, составляющим около 10 дней, что ограничивает долгосрочные исследования прогрессирования острого лимфобластного лейкоза или лекарственного ответа за пределами этого временного периода. Этот протокол устанавливает быстрый и экономически эффективный метод ксенотрансплантации in ovo клеток острого лимфобластного лейкоза, полученных от пациента, включая В-клеточные и Т-клеточные линии.

Этот протокол представляет собой многообещающий инструмент для доклинического скрининга лекарственных средств, механистических исследований и потенциально персонализированных подходов медицины в исследованиях лейкемии. Будет изучена возможность использования созданной in ovo модели ксенотрансплантата для доклинических применений. Для начала переложите заготовленные яйца в увлажненный инкубатор на колесиках с влажностью примерно от 50 до 60% и температурой 39 градусов по Цельсию.

Инкубируйте яйца в этом инкубаторе в течение 10 дней после оплодотворения. Переложите образцы крови в стерильную центрифужную пробирку объемом 50 миллилитров и разбавьте каждый образец три раза, используя два объема PBS. После центрифугирования образца вместе со средой с градиентом плотности соберите охристый слой мононуклеаров из границы раздела и перенесите его в новую стерильную 15-миллилитровую пробирку.

Добавьте в пробирку 10 миллилитров PBS и центрифугируйте пробирки при 300 G в течение пяти минут, чтобы удалить оставшиеся компоненты сыворотки. Ресуспендируйте гранулированные элементы в среде RPMI 1640 с добавлением 10% FBS. Используйте гемоцитометр для подсчета количества клеток.

Ресуспендируйте клетки в замораживающую среду, состоящую из 10% ДМСО в FBS. Оцените жизнеспособность клеток с помощью теста исключения трипанового синего и заморозьте клетки при температуре минус 80 градусов Цельсия и храните их в жидком азоте. Затем совместно трансфектируют 1,5 миллиона HEK 293 Т-клеток с желаемым плазмидным вектором с использованием липофектамина 3000 и инкубируют трансфицированные клетки в течение двух дней.

Соберите надосадочную жидкость, содержащую лентивирус, из колодцев и отфильтруйте ее через фильтр 0,45 микрометра для удаления мусора. Перенесите отфильтрованный вирусный надосадочный слой в центрифужные пробирки и центрифугуйте при температуре 20 000 G в течение двух часов при четырех градусах Цельсия. Для мечения 1 миллион клеток на миллилитр В-клеток-предшественников SEM и Т-клеток MOLT3, а также полученных от пациента клеток В- или Т-острого лимфобластного лейкоза в шестилуночные планшеты, содержащие RPMI 1640 с 10% FBS.

Визуализируйте клетки, меченные mCherry, под флуоресцентным микроскопом. На 10-й день осмотрите сосудистую сеть эмбрионов цыплят под светом, чтобы оценить жизнеспособность эмбрионов, аккуратно промойте поверхность каждого яйца 70% этанолом. С помощью ручной дрели просверлите в воздушную камеру каждого яйца, чтобы создать небольшое окошко диаметром примерно два сантиметра.

Заклейте созданное окошко прозрачным скотчем и верните яйца в инкубатор с содержанием углекислого газа 5%. На 11-й день введите 10 миллионов меченых mCherry клеток острого лимфобластного лейкоза в кровеносные сосуды развивающихся эмбрионов с помощью игл 34-го калибра. После закрытия окна верните яйца в инкубатор с 5% углекислым газом и ежедневно контролируйте жизнеспособность эмбрионов.

На 15-й день рассеките кровеносные сосуды у эмбрионов. Поместите их на предметные стекла и сфотографируйте успешные ксенотрансплантаты с помощью препарирующего микроскопа, оснащенного флуоресцентными возможностями. Соберите кровь из сосудистой сети куриных эмбрионов с помощью стерильного шприца с иглой 32 калибра.

Переложите кровь в стерильную пробирку объемом 1,5 миллилитра, содержащую гепарин, и центрифугируйте при 226 G в течение 10 минут при четырех градусах Цельсия. Мечите В-клеточные клетки острого лимфобластного лейкоза антителами к FITC CD10 человека и CD19 к ТЭЛА человека, а также клетки острого лимфобластного лейкоза человека антителами к FITC CD4 и ТЭЛА CD8 человека при четырех градусах Цельсия в темноте в течение 30 минут. Дважды промыть меченые клетки с помощью PBS, содержащего 1% БСА, и проанализировать с помощью проточной цитометрии Сосудистая колонизация клеточными линиями SEM и MOLT3 была четко видна через четыре дня после инъекции, что подтвердило успешное приживление в сосудистой сети развивающегося куриного эмбриона.

Полученные от пациента B-all и T-all клетки показали сильные флуоресцентные сигналы в кровеносных сосудах через четыре дня после инъекции, что указывает на активную колонизацию и пролиферацию в сосудистой сети. Проточная цитометрия выявила значительное увеличение CD10/CD19-положительных клеток у эмбрионов, введенных с помощью SEM, и полученных от пациента B-клеток через четыре дня после инъекции по сравнению с контрольной группой, собранной через шесть часов после инъекции. Аналогичным образом, CD4/CD8-положительные клетки были значительно выше в эмбрионах, введенных MOLT3, и в клетках T-all, полученных от пациента, через четыре дня после инъекции.