Создание in vitro моделей культуры ганглиев дорсальных корешков: дополнительные подходы к исследованию перекрестных помех между раком и нервом

Наше исследование сосредоточено на перекрестных помехах между раком и нервом с использованием 3D ганглиев дорсальных корешков или эксплантов DRG и 2D диссоциированных культур для количественной оценки нейроуправляемой миграции опухоли и тестирования молекулярных стратегий для ограничения их взаимодействия. С помощью этого протокола мы создали комплементарные 3D и 2D DRG культуры, оптимизировали рост нейритов и продемонстрировали увеличение инвазии раковых клеток вдоль нейритных расширений. Мы восполнили проблему нехватки воспроизводимых моделей, которые охватывают как сложные взаимодействия на клеточном уровне, так и архитектуру интактного нерва, создав взаимодополняющие 2D и 3D культуры DRG с помощью одной мыши.

Наш протокол позволяет получать парные 3D-экспланты и 2D-культуры нейронов от одной мыши, сохраняя угловатую текстуру, обеспечивая визуализацию с высоким содержанием контента, сокращая использование животных и позволяя нам получать данные на уровне тканей и отдельных клеток в одном эксперименте. Наша модель поставила вопрос о том, какие факторы, созданные DRG, вызывают инвазию, как активность нейронов, возраст и генотип формируют ее, а также может ли нацеливание на рецепторы нейротрофического фактора уменьшить распространение рака, управляемое нейритами. Для начала положите усыпленную мышь на его брюшко.

Сбрейте шерсть, уделяя особое внимание области над позвоночником, чтобы обнажить спинную поверхность. Распылите 70% этанол на спину животного. Бумажными полотенцами протрите от хвоста до черепа, чтобы удалить выпавшую шерсть и предотвратить загрязнение во время вскрытия.

Стерилизованными ножницами сделайте прямой разрез по спинной средней линии от хвоста к черепу. С помощью тупых щипцов втяните кожу с обеих сторон разреза, чтобы обнажить позвоночный столб. Теперь используйте свежие ножницы и щипцы, чтобы избежать загрязнения, и сделайте горизонтальный разрез на хвостовом конце позвоночного столба.

Затем сделайте два параллельных продольных разреза по обе стороны позвоночного столба, чтобы освободить его. С помощью щипцов мягко приподнимают позвоночный столб и удаляют окружающую соединительную ткань. Чтобы полностью освободить позвоночный столб, сделайте разрез в верхней части позвоночного столба рядом с черепом.

Перенесите позвоночный столб на предварительно охлажденную 10-сантиметровую пластину, содержащую HBSS со стрептомицином пенициллином, хранящимся на льду. Затем с помощью пружинных ножниц удалите остатки соединительной ткани из позвоночного столба и обнажите позвонки. Перенесите обрезанный позвоночный столб на предметный столик микроскопа.

Аккуратно расколите столбик по сагиттальной плоскости с помощью пружинных ножниц. С помощью щипцов с тонкими наконечниками удалите спинной мозг из колонны, чтобы выявить ганглии дорсальных корешков вдоль корешков спинномозговых нервов. Разрежьте спинномозговые нервы с помощью пружинных ножниц.

Затем удалите всю окружающую соединительную ткань из ганглиев дорсального корня. С помощью щипцов с тонким наконечником аккуратно извлеките ганглии дорсального корешка из дорсальных корешков. Для культивирования целиком поместите DRG в трехсантиметровую пластину, содержащую HBSS со стрептомицином пенициллином, хранящимся на льду.

Используйте предварительно охлажденные наконечники для дозатора для дозирования двух микролитров охлажденного Матригеля в каждую лунку восьмилуночного предметного стекла со стеклянным дном, помещенного внутрь 10-сантиметровой пластины со льдом. Чтобы предотвратить преждевременную полимеризацию, пипетку пидавайте только по одной капле за раз. Затем с помощью щипцов с тонким наконечником поместите один ганглий тыльного корешка на сухую пластину.

Аккуратно взболтайте, чтобы удалить излишки HBSS. Затем переложите чистый ганглий дорсального корешка в каплю Матригель. После переноса всех ганглиев в капли инкубируйте предметное стекло со стеклянным дном во влажном инкубаторе при температуре 37 градусов Цельсия в течение пяти минут, чтобы матригель мог полимеризоваться.

Далее осторожно добавьте в каждую лунку по 200 микролитров теплой дополненной питательной среды. Инкубируйте предметное стекло при температуре 37 градусов Цельсия с 5% углекислым газом. Используйте светлопольную микроскопию для ежедневного мониторинга ганглиев дорсального корешка на предмет роста нейронов и жизнеспособности.

Центрифугируйте 15-миллилитровую коническую пробирку, содержащую объединенные ганглии дорсального корня, при температуре 200 г в течение пяти минут при комнатной температуре. После дозирования HBSS промойте ганглии предварительно подогретой добавкой и аккуратно постукивающими материалами. Затем центрифугируйте пробирку в течение пяти минут при 200G, чтобы гранулировать DRG.

Замените среду одним миллилитром раствора папаина. Аккуратно перемешайте и инкубируйте при температуре 37 градусов Цельсия в инкубаторе для тканевых культур в течение 20 минут, осторожно перемешивая каждые пять минут. Далее добавьте 10 миллилитров дополненной среды, чтобы нейтрализовать папаин, и аккуратно перемешайте.

Центрифугируйте в течение пяти минут при 400G, чтобы гранулировать ганглии заднего корня. После пипетирования надосадочной жидкости добавьте один миллилитр коллагеназы IV типа в раствор Dispase II, и снова инкубируйте. Добавьте 4,5 миллилитра дополненной среды для нейтрализации ферментного раствора, аккуратно перемешайте и центрифугируйте.

После пипетирования надосадочной жидкости добавьте пять миллилитров дополненной среды. Затем добавьте Dnase I до достижения конечной концентрации 0,2 миллиграмм на миллилитр. Ганглии дорсального корешка теперь должны выглядеть как рыхлый комок, указывающий на полное пищеварение.

Для механической диссоциации используйте наконечник для пипетки с фильтром объемом 1000 микролитров для растирания раствора ганглиев путем пипетирования вверх и вниз четыре-пять раз. Переключитесь на наконечник для дозатора объемом 200 микролитров и повторите растирание путем пипетирования четыре-пять раз. Полученную мутную суспензию отфильтровать через 70-микрометровое клеточное ситечко в 50-миллилитровую коническую трубку.

Затем постепенно промывайте ситечко 10 миллилитрами среды, чтобы обеспечить полный перенос клеток. Центрифугируйте отфильтрованную суспензию клеток в течение пяти минут при 1000G для гранулирования клеток. Удалите среду из гранулы, и повторно суспендируйте клеточную гранулу в 500 микролитрах дополненной среды.

Удалите остатки PBS из лунок восьмилуночного предметного стекла со стеклянным дном. Диссоциированную суспензию ганглиев дорсального корешка распределите по лункам, покрытым коллагеном, и инкубируйте. Используйте светлопольную микроскопию для ежедневного мониторинга клеток, полученных из ганглиев дорсального корня, оценки жизнеспособности клеток и роста нейронов Для совместного культивирования целых ганглиев мыши с раковыми клетками сначала аспирируйте среду из целых культур DRG на восьмилуночном предметном стекле со стеклянным дном.

С помощью пипетки аккуратно добавьте 200 микролитров суспензии раковых клеток в лунку, содержащую каплю Матригеля и ганглии дорсального корня. Инкубируйте предметное стекло для совместной культуры во влажном инкубаторе при температуре 37 градусов Цельсия с 5% углекислым газом. Ежедневно обновляйте среду, промыв один раз 200 микролитрами подогретой добавки среды, и добавьте 300 микролитров свежей среды.

Для совместного культивирования диссоциированных ганглиев и раковых клеток аспирируйте среду из диссоциированных культур DRG на восьмилуночном предметном стекле со стеклянным дном. Затем аккуратно распределите по 200 микролитров суспензии раковых клеток в каждую лунку перед инкубацией. Создание DRG было менее эффективным в отсутствие добавок, и распространение нейритов было заметно сокращено.

Цельные DRG от старых животных производили менее обильное и более различимое удлинение нейритов и минимальное количество глиальных клеток, облегчая визуализацию взаимодействий клеток рака нервов. Диссоциация нейронов DRG с помощью двух ферментативных этапов привела к более высокому восстановлению нейронов. В течение 24 часов после культивирования стали заметны ненейрональные клетки, такие как клетки Швана, макрофаги и фибробласты, в то время как наблюдалось прорастание нейритов из клеток, полученных из DRG, и их дальнейшее увеличение увеличивалось через 72 часа.

Раковые клетки, посеянные в трансвелловые вставки, покрытые Матригелем, инвазировали в сторону клеток HEC293, но не в нейроны DRG после 24 часов инкубации. Целые культуры DRG, погруженные в каплю Matrigel, позволили нейритам распространяться наружу через матрицу к периферии. С тщательным расположением DRG по центру капли, обеспечивая максимальное удлинение нейритов без зарастания границ.

Раковые клетки оседали после 12 часов совместного культивирования вокруг границы капли Matrigel, содержащей DRG. После 72 часов совместного культивирования раковые клетки вторглись в Матригель и переместились к ганглию, при этом наблюдалось прямое взаимодействие между расширениями ганглиозных клеток дорсального корешка и раковыми клетками. Совместное культивирование диссоциированных клеток, полученных из DRG, с раковыми клетками позволило детально визуализировать индивидуальные клеточные взаимодействия.