Изготовление расширяемой матрицы мозга, настраиваемой на разных этапах развития

Изготовление расширяемой матрицы мозга, настраиваемой на разных этапах развития, автор Чепмен и коллеги из Университета Кентукки в Лексингтоне, Кентукки. Развитие мозга поросёнка во многих аспектах очень похоже на человеческий мозг. По сравнению с крысами и мышами, соотношение веса мозга поросят от рождения до зрелости гораздо ближе к человеческому, а функциональные области гирли и головного мозга поросят и человека очень похожи.

По этим причинам использование свиней и других крупных млекопитающих в нейронаучных исследованиях растёт. Однако коммерческие матрицы мозга для крупных млекопитающих дорогие, и выбор часто ограничивается одним размером или плоскостью сечения. В результате коммерческие матрицы могут не подходить для разных штаммов — как самцов, так и самок, а также разного возраста.

Это особенно проблематично для исследований в области развития нейронауки, где размеры мозга заметно меняются с ростом после родов. Например, мозги поросят быстро растёт в течение первых трёх месяцев, увеличиваясь более чем в три раза. Коммерческая матрица мозга поросят разработана так, чтобы помещать мозги от поросят только до двух недель.

Здесь мы представляем метод настраиваемого матричного построения на основе акриловых пластин как экономичное и простое решение этой задачи. Для этого эксперимента были получены четыре наивных четырёхдневных свиньи. Один из них использовался для анализа мозга в возрасте пяти дней, два — в 32 и один — в 38 дней.

После удаления мозга из черепа мозг фиксировали в формалине с 10% буфером на два дня и помещали в раствор сахарозы с 30% сахарозой на пять дней для криосохранения. Далее мы покажем, как сделать гипс мозга с помощью агарозного геля. Первый шаг к созданию матрицы — сделать форму мозга.

Мы проиллюстрируем процесс создания формы мозга пятого поросята послеродового дня, которая будет использоваться для создания сагиттальной матрицы. Положите полоску прочного пластика на дно стеклянной ёмкости, убедитесь, что оба конца выходят из краёв контейнера. Эта полоска облегчит извлечение агарозного блока.

Погрузите контейнер примерно наполовину в ведро с влажным льдом. В стеклянном стакане нагрейте 150 миллилитров PBS до 90 градусов Цельсия и добавьте шесть граммов агарозы, постоянно помешивая. Медленно вылейте раствор 4%агарозы, чтобы создать слой толщиной от половины до одного сантиметра на дне контейнера и дайте ему затвердеть.

Полностью покройте мозг тонким слоем минерального масла, чтобы агароза не привязывалась к поверхности мозга или не застряла в сулькусах. Масло также значительно облегчает удаление мозга из агарозного геля. После покрытия разместите мозг на тонком слое агарозы в нужной ориентации для корональной или сагиттальной формы, максимально прямой и вертикальной.

Дайте раствору агарозы остыть до 50 градусов Цельсия, постоянно помешивая, чтобы сохранить вязкость, которую можно выливать. Затем залить раствор агарозы на мозг, пока он полностью не впитается. Дайте агарозе затвердеть при комнатной температуре.

Разрежьте слой агарозы над мозгом хирургическим зондом, следуя контуру мозга. Когда резка будет завершена вокруг мозга, тонкую лопатку аккуратно снимите верхний слой агарозы. Будьте осторожны, чтобы не порезать и не поцарапать мозг во время этих этапов.

Аккуратно удалите весь мозг из формы. Он должен выходить относительно легко благодаря минеральному маслу, которое было нанесено на поверхность ранее. Обязательно удалите все мелкие кусочки агарозного геля, которые могли попасть в отпечаток.

Нагрейте 98 миллилитров PBS в стакане до 9 градусов Цельсия и добавьте четыре грамма агарозы и два миллилитра индийских чернил. Хорошо перемешайте. Залить этот раствор чёрной агарозы в отпечаток, оставляемый мозгом, стараясь не переполнить отпечаток.

Дайте чёрному гелю затвердеть. Держите оба конца пластиковой полоски и поднимите весь блок агарозы из контейнера. Сейчас мы покажем, как создать шаблонные пластины для вашей матрицы.

Чтобы разрезать форму для мозга, положите один лист бумаги между двумя прозрачными акриловыми пластинами диаметром 76 мм и приблизите их к краю стола. Затем используйте зажимы, чтобы закрепить четыре угловых квадрата и две акриловые пластины, чтобы построить две стены и плотно удерживать агарозные блоки в нужном положении. Передние края двух металлических угловых квадратов и двух вертикальных акриловых пластин должны быть выровнены вдоль одной стороны бумаги для масштаба.

Разместите агарозный гелевый блок так, чтобы край вырезанного вдоль бумаги и с краями вертикальных акриловых пластин и угловых квадратов, а также положите груз на противоположную сторону блока агарозы, чтобы удерживать его на месте. Уберите излишки с блока, пока индийский ink brain cast вот-вот не будет вырезан. Переместите блок агарозы вперёд на нужных шагах, например, на два или пять миллиметров с помощью отметок на подложенной бумаге.

Крепко возьмите лезвие обеими руками и проведите его по передним краям акриловых пластин и угловых квадратов, чтобы разрезать блок. Положите каждый кусок на второй лист бумаги и плотно прижмите, чтобы перенести отпечаток на бумагу. Ручкой обведите весь кусок.

Снимите срез и обведите контур мозга, определённый индийскими чернилами. Обратите внимание на ориентацию первого среза на бумаге для чешуйки, например, сзади и передней для сагиттальных срезов, и поддерживайте её последовательностью, когда на бумагу добавляются дополнительные срезы геля. Нумеруйте каждую трассу последовательно.

Разрежьте акриловые пластины до размера 10 на 8 1/2 сантиметра. Затем сложите их в стопку и закрепите на стадии сверления с помощью угловых квадратов и зажимов. Просверлите три отверстия в стопке с координатами, указанными в рукописи.

Снимите защитную пленку с акриловых пластин. Затем разместите акриловую пластину над шаблоном на бумаге и выровняйте верхние линии акриловой пластины с верхними краями шаблона. Обведите контур мозга на акриловой пластине перманентным маркером.

Маркируйте каждую пластину так, чтобы она совпадала с номером шаблона или трассировки мозга. Используя ленточную пилу, вырежьте каждую пластину вдоль копированных линий шаблона. В качестве альтернативы можно использовать ротационный инструмент с резьбой по дереву для удаления нежелательных участков.

Полируйте режущую кромку с помощью ротационного инструмента с наконечником для шлифовки, чтобы сгладить края, так как острые края могут повредить мозг при нарезках. Проверьте точность резки, положив акриловую пластину поверх шаблона. Подстригайте и полируете по необходимости.

Далее мы проиллюстрируем сборку пластин. Предварительно соберите матрицу, сложив пластины в последовательном порядке и проверяя их выравнивание. Сборка матриц начинается с прокладывания трёх длинных болтов из нержавеющей стали через первую акриловую пластину, а затем установки шайбы на каждый винт.

Поставьте вторую пластину и добавьте шайбы к каждому винту. В качестве альтернативы шайбы можно приклеить вокруг анкерных отверстий суперклеем, чтобы не добавлять шайбы по отдельности при каждой сборке. Повторяйте этот процесс, пока все пластины не будут последовательно добавлены к болтам.

Затягайте всё вместе с гайкой на каждом болте. Проведите финальную полировку краёв, обращённых к мозгу, чтобы перейти от пластины к пластине более плавно. Используйте маркеры разных цветов, чтобы покрасить верхний край акриловых пластин чередующимися цветами, чтобы нарезать их было гораздо проще.

Здесь мы чередовали чёрные, красные и немаркированные номера. Наконец, мы продемонстрируем процесс разреза мозга в корональной или сагиттальной плоскости. Чтобы разрезать мозг, поместите его в матрицу в той же ориентации, что и во время формовки, и максимально прямо.

Для разрезания мозга понадобится широкое, плоское лезвие. Широкое лезвие ограничивает возможность скручивания или изгиба во время разрезания. Рекомендуем использовать криостатное лезвие высокого профиля.

Для безопасности обмотайте около двух сантиметров одного конца лезвия лабораторной лентой, чтобы создать пространство для безопасного удержания обёрнутого конца при разрезании мозга. Небольшое предупреждение. Поскольку после фиксации формалином каждая часть мозга имеет разную текстуру, следует проявлять осторожность при равномерном давлении на лезвие.

Кроме того, мозг поросёнка большой, поэтому лучше использовать режущее движение для разреза, чем прямое, давящее вниз. Лезвие нужно тянуть с постоянной силой с одной стороны в другую, чтобы он проходил достаточно глубоко, чтобы разрезать весь мозг. Положите все ломтики в тарелку с шестью колодцами, наполненную PBS, или противень из нержавеющей сталки.

Аккуратно выложите ломтики в лоток, сохраняя порядок и ориентацию ломтиков, и сохраняйте или продолжайте по мере необходимости. Для корректировки геометрии или расширения полости для лучшего подхода к мозгу можно снять или добавить выбранные акриловые пластины для адаптации матрицы к разным размерам мозга. Здесь мы иллюстрируем расширение сагиттальной матрицы, построенной для мозга поросёнка P5, добавляя несколько пластин, здесь окрашенных синим и зелёным, в среднюю часть матрицы.

Матрица теперь подходит для сагиттального сечения поросята P38. Возможность расширять или уменьшать размер матрицы значительно увеличивает её гибкость и позволяет экономить как материалы, так и усилия. Как и при корональном разрезе, аккуратно разрежьте мозг в сагиттальной плоскости, используя последовательные пластины для управления лезвием.

Система цветокодирования помогает определить правильное последовательное расположение лезвия, что сложно, когда срезы тонкие. Выньте мозг из матрицы и аккуратно разойдите ломтики. В заключение, мы разработали простой, экономичный и гибкий метод создания матриц мозга для новорождённых поросят.

Эту концепцию можно применить к пожилым свиньям и другим крупным моделям животных.