Высокоплексная визуализация с использованием спектральной конфокальной микроскопии для минимизации неспецифической флуоресценции тканей

Мы оптимизируем рабочий процесс IBEX, сочетающий блокировку гепарина и спектральное обнаружение для подавления фона в тканях, богатых эозинофилами. Автофлуоресценция и связывание эозинофильных гранул скрывают истинный сигнал. Мы ориентируемся на оба варианта, чтобы обеспечить чистые карты высокого Plex.

Для начала нарисуйте круг на стеклянном слайде вокруг закреплённой ткани с помощью пап-пера, чтобы создать гидрофобный барьер. Добавьте примерно 100 микролитров PBS в каждую ткань для регидратации и инкубуйте затвор примерно две минуты при комнатной температуре, чтобы смыть оптимальную температуру для резки. Аспирируйте PBS вокруг ткани с помощью вакуумной пипетки Пастера.

Затем добавьте 100 микролитров блокирующего буфера в каждую ткань и инкубуйте при комнатной температуре в камере с влажностью в течение одного часа. Теперь аспирируйте блокирующий буфер с помощью пипетки. Добавьте 100 микролитров окрашивателя в каждую ткань и инкубировать стекло в закрытой камере с влажностью внутри холодильника при температуре 4 градусов Цельсия на ночь.

Аналогично, подготовьте участок, окрашенный только одним флуорофором и отрицательным контролем без окрашивания для определения спектра флуорофоров и аутофлуоресценции тканей. После аспирации смеси для окрашивания трижды промой ткань с помощью PBS, после каждого стирки аспирируйте жидкость. Поместите образец на микроскоп для съёмки.

Фокусируйтесь на образце с помощью режима контраста с ярким полем или дифференциальной интерференцией. Затем переключитесь в режим флуоресценции и настройте параметры спектрального захвата в соответствии с экспериментальными требованиями. Назначьте соответствующие лазеры для флуорофоров, используемых в эксперименте.

Выберите делитель луча, который соответствует выбранным лазерным линиям. Включите все детекторы для захвата полного спектра излучения и настройте разрешение получения изображения на одно из заранее заданных разрешений. Или выберите максимальное разрешение.

Отрегулировать размер отверстия на одну единицу площади для оптимального оптического сечения. Оптимизируйте настройки лазера перед захватом. Используя участок, окрашенный всеми маркерами, начинайте режим непрерывного сканирования при низкой мощности лазера.

Регулируйте главный усиление каждого детектора, а также интенсивность лазера, пока все маркеры не станут идентифицированы с хорошим соотношением сигнала к фону. Тонко настройте интенсивность лазера и итеративно чередуйте отдельные и многократные секции, пока все флуорофорные сигналы не станут видимы без перенасыщения. Включите функции тайлов в программном обеспечении для получения и определите область сбора плиток вокруг ткани для обеспечения полного покрытия изображения.

Оптимизируйте фокус для области набора плитки в центре ткани. Определить уникальную структурную особенность, например, отдельный набор клеток в узнаваемом расположении, чтобы служить ориентиром для выравнивания в последующих раундах. Теперь включите функцию Z-stack и перейдите на вкладку Z-stack.

В центральной вкладке установите количество срезов не менее шести с интервалом не менее одного микрометра между срезами. Нажмите на центральную кнопку, чтобы установить текущую точку фокуса, определённую на предыдущем этапе, как средний срез стека. Нажмите кнопку «Начать эксперимент», чтобы запустить получение изображений.

После завершения приобретения кликните правой кнопкой мыши по миниатюре изображения, выберите «Сохранить как». Выберите место файла и назовите изображение. Сделайте резервную копию данных изображений в безопасное хранилище. Размикшуйте изображение, используя те же оптимизированные настройки, что и при получении тайловых регионов.

Захватите снимок с каждого одноокрашённого элемента, чтобы получить истинный спектр сигнала, а из неокрашенного контроля — чтобы запечатлеть фон или автофлуоресценцию. Используйте эти изображения исключительно для спектрального смешивания. Убедитесь, что выбранная область представляет собой истинный сигнал, проверяя, что интенсивность и морфология отсутствуют или эквивалентны фоновым уровням в неокрашенном контроле, а локализация маркеров соответствует ожидаемому клеточному паттерну, такому как мембранный, ядерный, цитоплазматический или секретируемое распределение.

Откройте изображение snap в программе. Нажмите на вкладку unmixing и выберите один из инструментов выбора региона во вкладке unmixed tools, нарисуйте интересующую область или ROI вокруг положительного сигнала, чтобы сгенерировать спектр этой области. Сравните каждый генерируемый спектр с теоретическим спектром излучения соответствующего фторофора.

Убедитесь, что область точно отражает истинный сигнал. Назовите каждый спектр в соответствии с идентичностью флуорофора и сохраните его в спектральной базе данных. Далее загрузите тайлированное изображение и откройте инструмент размикшивания.

Используйте кнопку плюс, чтобы добавить эталонные спектры для каждого флуорофора в список размешивания. Нажмите кнопку линейного разведения, чтобы разделить спектральные сигналы и сохранить несмешанное изображение. Приготовьте отбеливающий раствор в вытяжной жидкости.

С помощью микролопатки взвесьте 10 миллиграммов борогидрида лития прямо в сухой стакан. Аккуратно добавьте 10 миллилитров ультрачистой воды в стакан и перемешайте, пока соединение полностью не растворится. Добавьте примерно 100 микролитров свежеприготовленного отбеливающего раствора в каждую часть ткани с помощью стеклянной пипетки Пастера и инкубируете стекли при комнатной температуре в течение 15 минут внутри выхлопчика.

Если отбеливающая фиолетовая отсекается, аккуратно перенесите стекло в эпифлуоресцентный микроскоп и выберите стильный фильтр. Сфокусируйте сэмпл и зажжите его на полной мощности. Теперь используйте объектив 5X для увеличения поля освещения и полностью опустите ступень, чтобы избежать контакта между затвором и объективом или корпусом.

Наконец, декантировать раствор борогидрида лития из каждой скважины с помощью стеклянной пипетки Пастера и вернуть его в исходный стакан с отбеливающим раствором. Мойте стекли три раза с буфером для разведения и инкубуйте примерно три минуты во время каждой стирки. Добавьте смешанную смесь антител и окрашьте образец, как показано ранее.

В необработанном полипе ткани носа окрашивание с CD3 CD4 и CD20 показало интенсивную неспецифическую гранулярную флуоресценцию в регионах, богатых эозинофилами. В то время как истинно мембранно локализованный сигнал присутствовал при меньшей интенсивности. Предварительное лечение 5%-обезжиренным молоком не смогло полностью блокировать неспецифическую флуоресценцию, а также снизило интенсивность сигнала для флуорофоров, таких как AF 532.

Предварительное лечение DAB снизило неспецифическую флуоресценцию по сравнению с CD20, CD3 и CD4, но также снизило истинную интенсивность сигнала по нескольким каналам, включая DAPI и AF 532. Предварительное лечение гепарином эффективно блокировало неспецифическое связывание, сохраняя при этом высокую интенсивность сигнала для CD3, CD4, CD20 и DAPI. Гепарин блокировал неспецифический сигнал в зависимости от концентрации, при полном подавлении при 10 единицах и отсутствии негативных эффектов при высоких концентрациях.

Трёхдорожная система визуализации сократила время получения, но вызвала перекрёстные помехи, включая проток AF 594 в канал ПЭ, а также улучшенную аутофлуоресценцию тканей за счёт множественных лазерных возбуждений. Спектральная визуализация практически полностью устранила фоновый и перекрёстный контакт, а также сократила время их обнаружения и улучшила соотношение сигнала к фону. Спектральная IBEX-визуализация человеческого носового полипа выявила эпителиальные структуры, отмеченные EpCAM.

иммунные клетки, такие как CD3 положительные и CD20-положительные лимфоциты, а также сосуды, экспрессирующие CD31 и CD34. Лечение гепарином устраняло связывание гранул без уменьшения сигнала, сохраняя сильное фоновое подавление в течение циклов IBEX. Спектральное разведение минимизирует проток и автофлуоресценцию увеличивает сигнал на фоновый план, что значительно ускоряет многопанельное получение по сравнению с многодорожечным конфокалом.

Это обеспечивает надёжную пространственную протеомику и сложные ткани, поддерживая точное картирование состояния клеток и анализ на уровне окрестностей.