Индуцирование целевой умеренной гипертермии на моделях опухолей мышей путем фототермического преобразования ближнего инфракрасного света внутриопухолевыми золотыми наностержнями

Таргетная гипертермическая терапия — это новый метод лечения рака, предназначенный для избирательного повышения температуры опухоли при минимизации повреждения окружающих здоровых тканей. Этот метод описывает высокоэффективный, малоресурсоемкий и воспроизводимый способ индуцирования гипертермии, опосредованной золотым наностержнем, в солидных опухолях. Использование прямого внутриопухолевого введения золотых наностержней с последующим воздействием ближнего инфракрасного света позволяет добиться точного, контролируемого и высоколокализованного нагрева опухолей.

Успех этого протокола зависит от эффективной активации глубоких тканей золотых наностержней с использованием соответствующей длины волны ближнего инфракрасного света, а также от точного мониторинга внутренней температуры опухоли в режиме реального времени на протяжении всей процедуры. Начните ежедневные измерения опухолей, начиная примерно с седьмого дня, после инъекции раковых клеток или всякий раз, когда опухоли становятся пальпируемыми. Перед началом процедуры измерьте ширину, длину и высоту опухоли, чтобы рассчитать общий объем опухоли.

Стремитесь выполнять процедуру, как только опухоли достигнут примерно 50 миллиметров в кубе. Для нашей модели этот объем опухоли был достигнут между 10 и 12 днями после инъекции раковых клеток. В стерильном шкафу биологической безопасности используйте шприц длиной в один мил с иглой 31 калибра, чтобы набрать соответствующий объем золотых наностержней на основе каждого объема опухоли.

Перед введением золотого наностержня обезболите мышь с помощью носового конуса, подающего 2%-ный изофлуран со скоростью потока 0,8 литра в минуту. Нанесите глазную смазку на оба глаза, чтобы предотвратить высыхание и свести к минимуму возможные повреждения лазером. При необходимости сбрейте лишнюю шерсть вокруг опухоли, чтобы обеспечить обнажение поверхности кожи, и используйте этанол для дезинфекции поверхности опухоли, вытирая шерсть или мусор.

Перед лазерным воздействием введите золотые наностержни внутриопухолево в концентрации один микрограмм на миллиметр кубического объема опухоли. При необходимости разделите инъекцию между двумя внутриопухолевыми участками, чтобы обеспечить эффективное распределение золотых наностержней внутри опухоли. Обязательно сотрите излишки золотых наностержней с поверхности кожи после инъекции.

Мышам контрольной группы вводят внутриопухолевую инъекцию стерильного PBS в объеме, эквивалентном тому, который использовался для групп лечения золотым наностержнем. Перед введением очистите внутриопухолевый температурный зонд этанолом. Аккуратно введите температурный зонд в середину опухолевой массы.

Нанесите равномерный слой геля алоэ вера толщиной около пяти миллиметров на поверхность опухоли, чтобы предотвратить изъязвление кожи и свести к минимуму риск термической травмы во время лечения. Отрегулируйте лазер так, чтобы он располагался непосредственно над серединой опухоли. Используйте таблицу поиска излучения, чтобы определить наилучшую высоту лазера на основе требуемого диаметра лазерного луча для покрытия площади поверхности опухоли.

Включите лазер и термоэлектрический источник охлаждения. Затем подключите лазерную систему к источнику питания. Включите термоэлектрический источник охлаждения.

Синий светодиодный индикатор включится, и через 30 секунд температура стабилизируется на уровне 25 градусов по Цельсию. На основе таблицы поиска излучения отрегулируйте выходной ток лазера, чтобы достичь целевой интенсивности излучения примерно в один ватт на квадратный сантиметр. В нашем эксперименте высота лазера 1,5 сантиметра, диаметр луча 1,3 сантиметра и лазерный ток 1800 миллиампер привели к значению излучения 0,82 Вт на квадратный сантиметр, что было оптимизировано для нашей модели опухоли.

С этого момента убедитесь, что все люди в лазерной операционной носят сертифицированные лазерные защитные очки для используемой длины волны света. Установите термокамеру рядом с лазерной платформой, направленной на мышь, чтобы контролировать температуру поверхности кожи во время лазерной процедуры. Начните запись с помощью программного обеспечения для регистрации данных с термосвязью и убедитесь, что график зависимости внутренней температуры опухоли от времени отображается в режиме реального времени.

Поверните ключ безопасности лазера, чтобы включить вывод источника. Начните введение лазера, нажав на ножную педаль Во время запуска лазера внутренняя температура опухоли начнет увеличиваться, что займет от примерно 15 секунд до двух минут, чтобы войти в целевой гипертермический диапазон от 42 до 48 градусов. Если внутренняя температура опухоли приближается к 48 градусам, уберите ногу с педали, позволив температуре снова снизиться.

Это падение температуры должно стать видимым в режиме реального времени на графике зависимости температуры от времени. Как только внутренняя температура опухоли снизится примерно до 43 градусов, снова включите лазерное введение с помощью ножной педали. Температура должна снова начать повышаться, не выпадая за пределы гипертермического диапазона.

Продолжайте в том же циклическом режиме лазера, чтобы убедиться, что опухоль остается в гипертермическом диапазоне. График зависимости температуры от времени должен начать отражать эту картину при выключении лазера. На протяжении всего периода поддержания гипертермии опухоли постоянно контролируйте температуру поверхности кожи, чтобы она оставалась ниже 50 градусов Цельсия.

После пяти минут поддержания гипертермии отпустите ножную педаль, чтобы остановить введение лазера и позволить внутренней температуре опухоли упасть примерно до 37 градусов по Цельсию. Как только температура опухоли вернется к нормальной температуре, снимите датчик для мониторинга температуры и сотрите излишки геля алоэ вера с поверхности опухоли. Извлеките мышь из анестетика конуса носа и следите за возбуждением животного перед возвращением в клетку Для восстановления после процедуры поместите клетку частично на грелку, как показано здесь.

Убедитесь, что мыши вернулись к нормальному поведению, прежде чем возвращать их в жилище. В этой таблице приведены значения излучения в ваттах на квадрат сантиметра для различных настроек выходного тока лазера в миллиамперах и рабочих расстояний в сантиметрах. Эта таблица используется для определения подходящей высоты лазера на основе требуемого диаметра луча для покрытия поверхности опухоли и достижения целевой интенсивности излучения примерно в один ватт на квадратный сантиметр.

Значения, выделенные зеленым цветом в этой таблице, указывают на оптимальные уровни излучения около одного ватта на квадратный сантиметр. На этом рисунке показаны репрезентативные профили внутренней температуры опухоли с течением времени в миллисекундах, зарегистрированные внутренним датчиком температуры опухоли во время воздействия ближнего инфракрасного света. На рисунке А показана схема циклического использования лазера в мыши, вводимой с помощью золотого наностержня, необходимая для поддержания внутренней температуры опухоли в гипертермическом диапазоне.

В нем подчеркивается важность тщательного контроля внутренней температуры опухоли и цикличности введения лазера для поддержания гипертермического диапазона на протяжении всей процедуры. На рисунке В показана средняя разница во внутренней температуре опухоли между мышами, введенными золотым нанародом, и контрольными мышами, или мышами, получавшими PBS, в течение пяти минут воздействия ближнего инфракрасного света. Без инъекции золотых наностержней опухоли, подвергшиеся воздействию ближнего инфракрасного света, не будут нагреваться до умеренного гипертермического диапазона.

PBS вводит опухоли на плато около 39-40 градусов по Цельсию, в отличие от опухолей, вводимых золотым наностержнем, которые достигают гипертермической температуры от 42 до 48 градусов. Наша таргетная гипертермическая терапия, опосредованная золотым наностержнем, вызывает уменьшение объема опухоли на нескольких зеркальных моделях рака в течение 48–72 часов после лечения. На рисунке А показаны измерения объема опухоли в 4T1, модели рака молочной железы после целенаправленной гипертермической терапии, опосредованной золотым наностержнем.

На рисунке B показана модель меланомы B16 F10, а на рисунке C показана модель колоректального рака CT26. Уменьшение или замедление роста объема опухоли в течение 48-72 часов после лечения свидетельствует о положительном результате. При выполнении этого протокола точный мониторинг внутренней температуры опухоли в режиме реального времени имеет решающее значение для обеспечения достижения умеренного диапазона гипертермии и последовательного проведения лечения.

После этой процедуры следует проводить ежедневные измерения объема опухоли, чтобы зафиксировать изменения объема опухоли. Регрессия опухоли в течение двух-трех дней является положительным показателем успешности лечения.