Достижения в метаболическом профилировании трехмерных сфероидов опухолей головного мозга для скрининга лекарственных препаратов

Исследование направлено на оптимизацию 3D-формирования клеточных корней клеток для изучения энергетического метаболизма с использованием технологии Seahorse, уделяя особое внимание поведенческой метаболической активности клеток и реакциям на лекарства в нашей клинически значимой модели. Эти результаты улучшат модели дозирования лекарств, обеспечивая более точное представление опухолей головного мозга, улучшая оценку терапии и метаболический анализ для лучших стратегий лечения. Полученные результаты проложили путь к исследованию того, как изменяется энергетический метаболизм в 3D-моделях сфероидов, как лекарства влияют на метаболические пути и механизмы, с помощью которых метаболические изменения способствуют развитию резистентности опухоли к терапии.

После ресуспендирования собранных элементов U87 в DMEM, разогрейте неиспользуемую среду до 37 градусов Цельсия. Выдерживать клеточные суспензии при комнатной температуре в течение 30 минут. Исходя из исходного количества клеток, разбавляют клеточную суспензию DMEM, содержащим 10% FBS, до конечного объема 20 миллилитров, обеспечивая примерно 200 000 клеток.

Окончательную клеточную суспензию тщательно перемешать путем повторной инверсии. Медленно добавьте по 200 микролитров суспензии по краю каждой лунки в прозрачное круглое дно сверхнизкой насадки 96-луночной пластины, затем плотно запечатайте пластину парапленкой, чтобы предотвратить утечку во время центрифугирования. Поместите герметичную пластину в центрифугу и работайте при температуре 200 G в течение двух минут, чтобы гранулировать ячейки на дне каждой лунки.

Снимите пластину с центрифуги. Осторожно снимите парапленку, и поместите тарелку в инкубатор с температурой 37 градусов Цельсия с 5% углекислым газом. Чтобы приготовить облицовочный раствор, растворите пять миллиграмм Поли-Д-Лизина в 50 миллилитрах стерильной воды, и тщательно перемешайте раствор, до полного растворения.

Добавьте по 30 микролитров лакирующего раствора в каждую лунку метаболической аналитической пластины. Обеспечьте отсутствие пузырьков, аккуратно встряхивая пластину или отсасывая излишки раствора. Инкубируйте пластину с закрытой крышкой в течение 20 минут при комнатной температуре, затем отсадите раствор для покрытия и дважды промойте лунки 200 микролитрами стерильной воды.

Высушите пластину на воздухе не менее 30 минут, затем нагрейте пластину до 37 градусов Цельсия без углекислого газа в течение 30 минут для стабилизации покрытия. После этого добавьте в каждую лунку по 175 микролитров предварительно разогретой среды. Держите планшет при температуре 37 градусов Цельсия в инкубаторе без углекислого газа, пока он не будет готов к переносу сфероида в клетку.

Перенесите сфероидные пластины в систему визуализации с высоким содержанием после пяти дней культивирования. Чтобы настроить параметры изображения, установите температуру на 37 градусов Цельсия и уровень углекислого газа на 5%Отрегулируйте тип пластины, каналы и диапазон фокусировки в настройках системы. Затем получите сфероидальные изображения с помощью конфокального микроскопа с 10-кратным объективом и программным обеспечением для визуализации, затем определите лунки, содержащие неповрежденные сфероиды, и запишите их положение для переноса.

Распределите интактные сфероиды на две группы: контрольную группу с шестью реплицирующими лунками и группу лечения с шестью реплицированными лунками для лечения фенофибратом. Приготовьте рабочий раствор фенофибрата в свежей предварительно прогретой среде в оптимальной концентрации. Осторожно извлеките сфероид с пластиной с низким уровнем прикрепления из системы визуализации и поместите его на стерильную поверхность в шкафу биобезопасности.

Расположите планшет для анализа, покрытый поли-D-лизином, рядом с ним для переноса, затем обрежьте кончик пипетки объемом 20 микролитров, чтобы обеспечить мягкую аспирацию сфероидов клеток без повреждения. С помощью обрезанного кончика пипетки аккуратно отсасывайте каждый неповрежденный сфероид со дна его лунки. Перенесите каждый сфероид в соответствующую лунку пластины с покрытием и дайте ему отстояться в течение 20 секунд.

Перенесите 3D-планшеты для анализа сфероидов в систему визуализации с высоким содержанием содержимого. Чтобы проанализировать морфологические данные, примените модуль текстурной области, чтобы грубо отделить 3D-сфероиды от фона, разделив содержимое изображения на три кластера на основе особенностей текстуры. Примените модуль «Поиск области изображения» для уточнения разделения предварительно изолированных 3D-сфероидов с использованием объемных размерных характеристик, обеспечивая удаление примесей и сохранение неповрежденных сфероидов.

Измерьте морфологические параметры 3D-сфероидов с помощью модуля морфологические свойства. Примените модуль выбора популяции для фильтрации и сохранения только подлинных сфероидов 3D-клеток, а затем экспортируйте результаты морфологических данных. Сфероиды заметно сформировались к пятому дню культивирования, поддерживая однородную сферическую морфологию во всех наблюдаемых образцах.

Разрушенный сфероид с заметно нарушенной структурной целостностью также наблюдался на пятый день. Анализ после переноса показал, что как контрольные, так и обработанные фенофибратом 3D-сфероиды в большинстве случаев оставались нетронутыми, но некоторые сфероиды, обработанные фенофибратом, были разрушены. Скорость потребления кислорода была значительно снижена у сфероидов, получавших фенофибрат, во все временные моменты по сравнению с контрольной группой.