Моделирование митохондриальных заболеваний с использованием органоидов головного мозга: акцент на митохондриальную энцефаломиопатию, лактатацидоз и инсультоподобные эпизоды

Цель наших исследований — понять измерители митохондриальных заболеваний и найти лекарства для их лечения. Задача заключается в сохранении способности к высокопроизводительным анализам, даже если техника включает образование органоидов. Для начала удалите среду из индуцированных плюрипотентных столовых клеточных культивных пластин, когда они примерно 70–80% совпадают друг с другом.

Промой клетки PBS. Добавьте 350 микролитров ферментного раствора в клетки и инкубируете. Добавьте 800 микролитров среды для посадки стебля, чтобы остановить реакцию.

После переноса суспензии ячейки в новую трубку центрифугайте её при температуре 190G в течение пяти минут при 22 градусах Цельсия. Далее снова подвесьте гранулу в одном миллилитре дифференциационной среды. После подсчёта клеток посейте по 3000 клеток по 100 микролитров в каждую яме U-образной пластины с низким уровнем прикрепления с 96 лунками.

Инкубировать шесть дней при 37 градусах Цельсия с 5% углекислого газа. После инкубации используйте пипетку широкого диаметра, чтобы переместить органоиды из пластины на 96 лунок в чашу диаметром 10 сантиметров. Pipette 50 микролитров дополнительной среды DMEM/F12 в каждую скважину новой пластины на 96 скважин.

Соберите органоиды в двухмиллилитровые трубки. Аккуратно удалите материал, не аспирируя органоиды, и добавьте 1,5 миллилитра дополнительной смеси DMEM/F12. После последней промывки пипеткой добавьте 500 микролитров свежей среды.

Затем переложите органоиды в тарелку диаметром 10 сантиметров. Добавьте пять миллилитров среднего вещества для облегчения выбора каждого органоида. Переместить все органоиды в каждую яме пластины на 96 лунок с помощью микропипетки с объёмом 50 микролитров и инкубировать в течение трёх дней.

На девятый день соберите органоиды в двухмиллилитровые трубки и трижды промой с помощью DMEM/F12. Затем органоиды снова суспендируют в дифференциационной среде. Перенесите примерно 10 органоидов на каждую скважину в пластину из шести лунок и отрегулируйте итоговый объём среды в каждой яме до двух миллилитров.

Культивируйте пластину статически в течение шести дней при 37 градусах Цельсия с 5% углекислого газа. На 15-й день соберите органоиды в трубки по 15 миллилитров. После того как трубки осесть, добавьте свежую дифференциационную среду с витамином B27 и витамином A после пипетирования супернатанта.

Перенесите примерно 10 органоидов на каждую скважину в пластину с шестью лунами. Культивируйте органоид статическим образом в течение 15 дней при 37 градусах Цельсия с 5% углекислого газа. Покройте посевные пластины разбавленной поли-L-орнитиновой раствором.

Инкубировать тарелки ночью при 37 градусах Цельсия. На следующий день помой колодцы три раза по пять минут каждый с помощью PBS. Теперь добавьте разбавленный раствор ламинина в колодцы.

Инкубировать тарелки в течение трёх часов при 37 градусах Цельсия или на ночь. Центрифугуйте органоидную подвеску при 200G на пять минут. Удалите супернатант и добавьте один миллилитр ферментного раствора.

Хорошо перемешайте и инкубуйте при 37 градусах Цельсия в течение пяти минут перед центрифугом. После удаления супернатанта и добавления одного миллилитра раствора для дисперсий аккуратно положите изоляционный раствор под подвеску. Затем центрифугуйте подвеску при 200G на пять минут.

Теперь введите в трубку один миллилитр нейронной среды. Смешайте раствор и пропустите подвеску через 70-микрометровое сито в 50-миллилитровую трубку. После подсчёта ячеек засекают суспензию клетки с плотностью 100 000 клеток на квадратный сантиметр на пластины, покрытые поли-L-орнитином и ламинином.

Меняйте среду каждые четыре-семь дней до 60-го дня. Чтобы закрепить органоиды для иммунофлуоресценции, сначала собирают их в микротрубки. Промывайте органоиды PBS, затем фиксируйте их в 4% параформальдегиде на 30 минут при комнатной температуре.

После фиксации промой фиксированные органоиды три раза с помощью PBS. Храните органоиды при четырёх градусах Цельсия до использования. Через 30 дней после посева для 2D нейронной культуры удалите культурную среду с пластин.

Затем промой клетки PBS. Зафиксируйте клетки 4% параформальдегидом на 15 минут при комнатной температуре. Выведите параформальдегид пипеткой, затем три раза промывайте клетки PBS.

Сохраняйте фиксированные ячейки при четырёх градусах Цельсия до их использования. Чтобы собрать органоиды для RTQPCR, переместите их в микротрубки. Pipette PBS в трубки, чтобы промыть органоиды.

Теперь добавьте 350 микролитров лизисного буфера к органоидам, затем быстро заморозьте их в жидком азоте. Храните трубки при минус 80 градусах Цельсия до использования. Органоиды мозга, содержащие положительные нейроны FOXG1, были успешно индуцированы из здоровой контрольной линии IPSC 414C2 на 30-й день, а 2D-культивированные нейронные сети — на 60-й день.

Гетероплазматические уровни варианта M.3243A до G были подтверждены QPCR. Линии со второй по восьмую имели низкую гетероплазму, а линии со второй по шестую — высокую гетероплазму. Органоиды мозга, происходящие из линии низкой гетероплазмы от дветой до восьми, имели размеры и морфологию, схожие с морфологией у здоровых контрольных групп.

Органоиды, полученные из линии высокой гетероплазмы от второй до шести, имели уменьшенный размер на 0,3 квадратных миллиметра и неправильную морфологию с круговым значением 0,82. Большинство нейронов, индуцированных с линии 414C2 и линии с двумя по восьмую линии, были положительными на FOXG1 на 30-й и 60-й днях. Положительные нейроны FOXG1 редко обнаруживались в органоидах или 2D-культивированных нейронах, полученных из двух-шестой линии.

Наши результаты показывают, что органоидные модели, основанные на IPSC, являются полезной платформой для изучения зеркал, механизмов и скрининга лекарств. Наши традиционные методы с коротким временем культурирования и экономичностью предоставляют практические инструменты для изучения патофизиологии MELIS. Мы хотели бы искать потенциальные препараты для MELIS, используя соединения, которые пациенты будут доставляться в будущем.