Характеристика секреции внеклеточных везикул, полученных из адипоцитов, с использованием модели мышей с репортером CD63-GFP in vivo и in vitro

Мы изучаем внеклеточные везикулы, полученные от адипоцитов (EV), чтобы определить их роль в жировой ткани, в частности, как они регулируют перекрёстные контакты между зрелыми адипоцитами и их предшественниками. В настоящее время не существует систем in vivo для изучения секреции EV адипоцитов, а существующие протоколы очистки ещё не полностью оптимизированы. Для начала используйте стерильную технику для удаления паховой жировой ткани у усыпленных мышей.

Поместите один грамм ткани в двухмиллилитровую трубку, содержащую 0,5 миллилитра пищеварного буфера. С помощью стерильных ножниц измельчите ткань на куски не больше одного миллиметра. Суспензировать измельченную ткань в 10 миллилитрах буфера пищеварения, содержащего 0,5 миллиграмма на миллилитр либеразы и 50 единиц на миллилитр ДНКазы I. Инкубировать образец при 37 градусах Цельсия на орбитальном шейкере.

Во время инкубации несколько раз аккуратно инвертируйте трубку. Когда раствор становится мутным и не остаётся видимых фрагментов ткани, пищеварение завершённо. Для выделения стромальной сосудистой фракции (SVF) разведите переваренную суспензию двумя объёмами буфера пищеварения.

Аккуратно переверните трубку три-четыре раза, чтобы хорошо перемешать. Пропустите суспензию через стерильный фильтр диаметром 100 микрометров, чтобы удалить непереваренные ткани, затем центрифугуйте фильтрат при температуре 300 г в течение пяти минут при температуре 4 градусов Цельсия. Маркируйте пеллету как SVF.

Инкубировать стромальную сосудистую фракцию в свежеприготовленном буфере лиза эритроцитов на льду в течение пяти минут, защищённых от света. Добавьте два объёма буфера для стирки и центрифугу при температуре 400 г на пять минут при 4 градусах Цельсия. Суспензировать стромальную сосудистую фракцию в 80 микролитрах буфера на грамм ткани и перенести содержимое в новую трубку.

Добавьте 20 микролитров не-адипоцитного коктейля для истощения прогениторов на грамм ткани. Инкубировать образец в течение 15 минут при температуре от двух до восьми градусов Цельсия в темноте. Пропустите образец через колонку LS и соберите поток, содержащий отрицательную клеточную долю линии.

Центрифугуйте поток при температуре 300 г в течение пяти минут при 4 градусах Цельсия, чтобы получить клетки-предшественники адипоцита. Инкубировать 250 микролитров изолированных мышей-прогениторных клеток адипоцита мышей на восьмикамерные стекли с коллагеном в течение шести часов. Зафиксируйте клетки 4% параформальдегидом на 10 минут, чтобы сохранить клеточные и внеклеточные пузырьки для визуализации.

Далее три раза промой стекли с помощью PBS, затем креплю с антифейд-медиумом. Далее, после подсчёта предшественников адипоцита, подвешивают их и разбавляют краситель жизнеспособности. Инкубировать на льду в течение 20 минут, защищая от света.

Промой клетки один раз буфером для промывки и центрифугой. Подвесить клетки в ярком буфере для окрашивания, чтобы конечная концентрация составила 1 миллион клеток на 100 микролитров. Блокируйте неспецифическое связывание, добавив реагент, блокирующий Fc-рецепторы в соотношении один к 100, и инкубируйте.

Свободно вращайте антитело SCA-1 в концентрации 6000 г в течение 10 минут при 4 градусах Цельсия. Добавьте антитело SCA-1 в пробирку APC при разбавлении от 1 до 100, затем поместите трубку на лёд, защищённую от света. Промыйте клетки дважды с помощью одного миллилитра буфера для мойки, затем центрифугуйте при температуре 300 г в течение пяти минут при 4 градусах Цельсия.

Подвесить ячейки в буфере промывки для сортировки проточной цитометрии, затем получить данные по положительным клеткам SCA-1 и GFP положительным с помощью спектрального потокового цитометра, оснащённого фиолетово-синим лазером. Для начала дифференцировки покрывайте чаши 0,2% желатином в течение 30 минут при комнатной температуре. Семена свежеизолированных APC в дополненной среде DMEM/F12 и инкубировать до слияния.

Замените среду с первого по восьмой день на адипогенную дифференциационную среду MesenCult. На девятый день промывайте адипоциты дважды PBS, затем замените среду на зрелую адипоцитную культурную среду с DMEM 1% BSA и 0,2% Primocin. Для выделения внеклеточных везикул, выделяемых адипоцитами, сначала пропустите 15 миллилитров культурной среды через 40-микрометровый фильтр, затем 30-микрометровый фильтр.

Центрифугуйте фильтрат при 500 г в течение пяти минут, затем центрифугайте супернатант при 2000 г на 10 минут, чтобы удалить остатки клеток и мусор. После того как получившийся супернатант прошёл через фильтр диаметром 0,8 микрометра и переместить фильтрат в 15-миллилитровую ультрафильтрацию, центрифугировать при 4000 г в течение 15 минут для концентрации среды. Загрузите концентрированный образец на колонку хроматографии с исключением размера, подключённую к автоматическому коллектору фракций, и собирайте фракции от F1 до F8.To проведите вестерн-блот-анализ, концентрируйте каждую фракцию от 400 до 25 микролитров.

Пипетта — 50 микролитров буфера для радиоиммунопреципитаципации, дополненных ингибиторами протеазы и фосфатазы в концентрат. Добавьте 75 микролитров двух буферов нагрузки 2X SDS, чтобы денатурировать образец и разрешить белки на геле Tris-Glycine с 4%–12%. Для анализа отслеживания наночастиц разведите образцы внеклеточных везикул с помощью 0,1-микрометрового стерильного PBS и аккуратно перемешайте.

Загрузите разбавленный образец в прибор NTA, оснащённый высокочувствительной научной полупроводниковой камерой с комплементарным оксидом металла и 532-нанометровым зелёным лазером. Установите обнаружение частиц от 10 нанометров до 1 000 нанометров и при концентрации 10 на степени шесть-десять при степени девяти частиц на миллилитр. Жировые прогениторные клетки у мышей стоп-стая-стая/CD63GFP не показали обнаруживаемого зелёного флуоресцентного белка пункта при конфокальным микроскопии.

В то время как клетки мышей AdipCD63 демонстрировали множество различных зелёных флуоресцентных белков по всему цитоплазме. Анализ потоковой цитометрии показал, что 1,2% положительных клеток черепа 1 у репортерских мышей экспрессировали зелёный флуоресцентный белок по сравнению с 12,6% у мышей AdipCD63-GFP. Вестерн-блоттинг хроматографических фракций с исключением размера показал, что внеклеточные пузырьковые маркеры CD63 и HSP70 обогащены фракциями F1 и F2. В то время как маркеры эндоплазматического ретикулума и митохондрий отсутствовали, что подтверждало везичную чистоту.

Анализ отслеживания наночастиц показал, что внеклеточные везикулы, полученные из адипоцитов, имеют размер от 50 нанметров до 500 нанометров, а трансмиссионная электронная микроскопия подтвердила, что везикулы имеют целостные двойные мембранные структуры. Western Blot подтвердил нокаут STX4 в адипоцитах. Конфокальная микроскопия показала, что положительные везикулы CD63-GFP рассеиваются по цитозолю в дикой адипоцитной зоне, но накапливаются возле плазматической мембраны в нокаутных адипоцитах STX4.

Концентрация внеклеточных везикул, выделяемых из адипоцитов адипоцита, была значительно снижена в нокаутных адипоцитах STX4 по сравнению с диким типом. Вестерн-блот равных белковых количеств внутриклеточных везикул показал сниженную экспрессию CD63 и CD81 в нокаутных адипоцитах STX4 по сравнению с диким типом. Протокол обеспечивает надёжную и воспроизводимую систему для изучения секреции EV адипоцитов in vivo и in vitro, а также оптимизированный метод очистки EV адипоцитов.

Протокол впервые описывает и подтверждает использование серийных низкоскоростных центрифуг в сочетании с хроматографией исключения размеров для очистки ЭВ, полученных из зрелых адипоцитов. Наши открытия позволяют нам задавать новые вопросы о том, как адипоциты используют внеклеточные везикулы для общения с другими типами клеток в физиологических и патологических условиях.