Эффективная регенерационная трансформация бесполого амфибийного вида Brassicaceae, Rorippa aquatica

Мы решаем проблему отсутствия простого масштабируемого конвейера трансформации агробактерий для бесполых растений, позволяющего проводить молекулярный анализ функций генов. Недавно исследования целого генома и физиологической экспрессии генов ввели rorippa aquatica в качестве модели гетерофилического заболевания. Он полезен для изучения молекулярной основы адаптации суши к воде.

Для начала выберите двухмесячные растения, которые имеют здоровые листья с целыми краями. Подготовьте лоток для размножения растений размером 20 на 30 сантиметров с двумя слоями бумажных полотенец для автоклава. Аккуратно сложите бумажные полотенца и насытите их стерильной водой, пока на поверхности не останется тонкий слой воды.

Убедитесь, что лабораторный стол оснащен 100–500 миллилитрами двойной дистиллированной воды, стерильными контейнерами, подходящими для ожидаемого объёма восстановленного инокуля, микропипеткой и соответствующими наконечниками пипетки. Теперь быстро вырежьте 10 листьев у основания лепестка с выбранных растений с помощью ножниц и положите их в чашку Петри с стерильной водой. Через 2,5 часа пипетка на 50 микролитров поверхностно-активного вещества на литр раствора ресуспензии для достижения концентрации 0,005% поверхностно-активного вещества.

Аккуратно покрутите колбу, чтобы перемешать раствор, и убедитесь, что подготовленный лоток для размножения доступен для установки экспланта после инокуляции. Теперь положите лист так, чтобы абаксильная сторона была обращена вверх. С помощью скальпеля разрежьте перпендикулярно вдоль среднего ребра листа на части длиной один сантиметр и поместите их в 50-миллилитровую трубку, подходящую для использования в вращающейся трубочной смесительной машине для использования в качестве эксплантов для инокуляции.

Залить в трубку Agrobacterium inoculum в объёме, достаточном для полного насыщения всех эксплантных материалов. Поставьте трубку на ротационный миксер и перемешайте при комнатной температуре 10 минут для проведения инокуляции. Затем, используя щипцы, удалите из раствора все прививочные листовые экспланты и сразу поместите их в подготовленный лоток для размножения.

Разделите и равномерно распределите пропитанные экспланты так, чтобы они были частично погружены, но не полностью в тонкий слой воды поверх пропитанных бумажных полотенец. Затем запечатайте лоток для размножения пищевой пленкой. Поставьте лотки в тёмную среду и инкубуйте при температуре окружающей среды 22 градуса Цельсия в течение трёх дней.

После завершения тёмного инкубационного периода убедитесь, что лотки остаются герметичными прозрачной пластиковой пленкой. Затем добавляйте в лотки двойную дистиллированную воду по мере необходимости, чтобы поддерживать уровень влажности. Переносите лотки для инокуляции в камеру роста и поддерживайте их в условиях вегетативного размножения.

Визуально осмотрите восстановленные розетки на предмет пригодности для пересадки. Определите идеальный вариант, подтвердив наличие целого желоба с множеством листьев и корней длиной не менее двух-трёх миллиметров. Затем удалите целые трансгенные розеточные растения с помощью щипцов.

Пересаживать вырезанные растения в тех же условиях, что и для дикой клональной регенерации. Вырезать розетку, зажжённую розеткой, осторожно избегая контакта с трансгенными листьями. Обрезайте лишнюю листву непосредственно вокруг трансгенного листа и пересаживайте по одному растение в каждом горшке.

После удобрения каждого пересаженного растения тщательно полийте, опрыскивайте листву и размещайте растения в подходящих условиях. Наконец, возвращайте экспланты с трансформаторами, которые не имеют побегов и корней или кажутся слишком маленькими для пересадки в лоток для размножения. Продолжайте отсеивать эти экспланты и пересаживайте их, когда они достаточно вырастут.

Большинство месячных саженцев, наших саженцев одного Т, демонстрировали химерные рисунки выражения рубинов, а небольшое количество полностью экспрессировали рубиновые листья. Сохранившийся в зрелом возрасте шести месяцев, наш саженец T One проявил химерную рубиновую экспрессию. Химерные рубиновые пигментированные листья сектора, вырезанные из наших саженцев одного Т-1, были способны к бесполому размножению.

Вырезанные части химерных листьев регенерировали либо в полностью рубиновое выражение, либо в химер, наши расташники одной Т — одна розетка в течение двух-четырёх недель после удаления с видимым формированием корней во время регенерации. Через месяц у большинства наших двух саженцев T One преимущественно были рубиновые листья. Наш протокол обходит этапы стерильной культуры тканей и обеспечивает регенерационный конвейер для бесполых растений, размножающихся вегетативно, без семян и цветов.

Наши исследования активации этиленовых путей в rorippa aquatica при погружении дают ключевые сведения о реакции наземных растений на погружение. Наш метод открывает двери для изучения того, как световые и гормональные пути позволяют этому амфибийному растению метаморфозироваться под водой.