Спектроскопическая сверхразрешающая визуализация молекул ДНК с использованием внутреннего контраста
6 марта 2026 г.
Этот протокол обеспечивает детальные операции по подготовке образцов, сбору данных и анализу внутренних флуоресцентных спектров ДНК.
Наши исследования представляют первый протокол измерения внутренних флуоресцентных спектров молекул ДНК, позволяющий изучать их нативные оптические свойства и характеристики, связанные с подтверждением последовательностей. Этот протокол использует эндогенную флуоресценцию для спектроскопической визуализации ДНК, избегая индуцированных нарушений маркировки, ошибок связывания и несогласованной маркировки плотности в существующих методах. Для начала растворите образец ДНК в деионизированной воде без нуклеазы до конечной концентрации 100 миллимоляров.
Приготовьте пять микролитровых аликвотов раствора ДНК, чтобы минимизировать повторяющиеся циклы замораживания и оттаивания. Храните дополнительные трубки с настоящим раствором при 4 градусах Цельсия. С помощью лабораторной салфетки аккуратно очистите стеклянную стекло.
Пипетить пять микролитров раствора 100-миллимолярной ДНК на свежеочищенный стеклянный стекло и дать образцу высохнуть в течение одного-трёх часов, чтобы получить ДНК-гель. В выхлопчике подготовьте либо буфер бета-меркаптоэтанола, либо буфер для визуализации DABCO для поддержки стохастического фотопереключения молекул ДНК. Нанесите пять микролитров буфера для визуализации на ДНК-гель и положите крышку сверху образца.
Если внутри покрытого образца есть пузырьки, используйте пинцет, чтобы их удалить. Получить изготовленный массив нанодыр с отверстиями диаметром 100 нанометров, расположенных на расстоянии четырёх микрометров, расположенных в восемь рядах и пять столбцов. Включите систему sSMLM и вставьте узкие фильтры полосы пропускания прямо перед камерой.
Поместите калибровочный образец под микроскоп и включите лампу, чтобы осветить образец. Установите время экспозиции на 200 миллисекунд для всех фильтров, а для фильтра 750 нанометров — на 2 000 миллисекунд. Перейдите к получению и ускорить таймлапс, чтобы отрегулировать количество кадров до 10 для каждого фильтра.
После калибровки загрузите образец ДНК-геля на стадию микроскопа так, чтобы крышка была обращена к объективу, и откройте программное обеспечение камеры для сбора данных. Определите подходящее Z-положение с помощью автоматической системы отслеживания фокуса и отрегулируйте фокус, пока не станет видно чистое стохастическое мигание. Убедитесь, что объектив не касается края крышки, чтобы предотвратить утечку буфера в погружное масло и помехи отслеживанию.
Снимите около 10 000–30 000 кадров с нужной мощностью освещения и временем экспозиции 30 миллисекунд. После сбора данных разрешите программе по умолчанию сохранять данные в формате nd2. Утилизируйте стеклянное стекло в одобренный мусорный контейнер, предназначенный для разбитого стекла или острых предметов.
Выбросьте все оставшиеся буферы в специально отведённый контейнер для химических жидких отходов в соответствии с институциональными нормами безопасности. Откройте Fiji и используйте плагин bio formats, чтобы загрузить полученный необработанный стек образца ДНК. Выберите изображение, затем стеки, Z Project, и выберите минимальную интенсивность как тип проекции для генерации минимальной проекции в RAW-стеке.
Выберите калькулятор изображения и вычтите минимальную проекцию из RAW-стека. Сохраните фоновый вычитаемый набор данных в виде TIF-файла для спектрального анализа. Далее выполните идентификацию локализации на исходном стеке изображения нулевого порядка с помощью плагина ThunderSTORM версии 1.3.
Установите порог на 1,2 стандартной волны отклонения. F1 — радиус трёх и сигма 1,5 для восстановления изображения нулевой порядка и извлечения координат эмиссионных событий. Для обрезанного raw стека нулевой порядка выберите плагин, затем ThunderSTORM и запустите анализ.
Используйте Fiji и открытое программное обеспечение RainbowSTORM с версией MATLAB новее 2020b для обработки калибровочных данных и получения связи между горизонтальными и вертикальными сдвигами и длинами волн. Выполните идентификацию локализации на калибровочных изображениях пяти длин волн с помощью плагина ThunderSTORM. Установите порог в пять раз больше стандартного отклонения — волна.
F1, с радиусом трёх, и сигмой 1,5 для реконструкции локализаций нанодыр на нулевом порядке и соответствующих спектральных локализаций первого порядка. Получите среднее изображение каждого калибровочного сигнала и отрегулировать порог в диапазоне от пяти до десяти стандартных волн отклонения. Для каждого калибровочного изображения получается локализация от F1 до 80.
Запустите RainbowSTORM и нажмите «Browse в спектральной калибровке», чтобы загрузить CSV-файлы для каждой калибровочной длины волны. Затем нажмите сохранить файл калибровки, чтобы сохранить файл калибровки. Используйте кастомизированный скрипт Python версии 3.11.7 для извлечения полного спектра данных.
Затем задайте правильные пути к файлу в скрипте Python для фонового стека изображений в формате TIF из предыдущего этапа фонового вычитания. Задайте путь файла для CSV-файла локализации, полученного на этапе анализа локализации, и калибровочного файла в формате MAT, полученного на этапе калибровки. Затем установить горизонтальный сдвиг на 925–984 пикселя для 532-нанометровых данных, полученных с помощью 3D-DWP, соответствующего спектральному окну от 525 до 750 нанометров, чтобы обеспечить покрытие за пределами диапазона фильтров от 590 до 650 нанометров.
Отрегулировать вертикальный сдвиг до 23 пикселей для данных размером 488 и 532 нанометров, полученных с помощью 3D DWP на основе спектральной калибровочной кривой, полученной с помощью RainbowSTORM. Наконец, линеаризуйте нелинейный спектр с помощью полиномиального подгонки третьего порядка для последующего сравнения и классификационного анализа. Была проведена спектральная калибровка, позволившая измерить соответствующие горизонтальные и вертикальные сдвиги пикселей между изображениями нулевого и первого порядка.
Это позволяло отображать калибровочную кривую между положением пикселя и длиной волны. Нелинейные и преобразованные линейные эмиссионные спектры при возбуждении 532 нанометра были получены для GC alter, который относится к типу двухцепочечной молекулы ДНК. Зелёная кривая представляла средний спектр.
Нелинейные и преобразованные линейные эмиссионные спектры A10C10, типа одноцепочечной молекулы ДНК, были получены при возбуждении 488 нанометров, при этом синяя кривая представляла средний спектр. Этот протокол позволяет исследователям измерять внутренние флуоресцентные спектры синтезированных одно- и двухцепочечных молекул ДНК с помощью спектроскопической сверхразрешающей визуализации. Точное определение правильного положения Z крайне важно, так как образцы ДНК-геля не имеют структурной информации и требуют тщательного фокуса для наблюдения стохастических морганий.
Будущие исследования могут расшириться на измерение внутренней флуоресценции РНК и белка, интеграцию вычислительных моделей для прогнозирования последовательностей и визуализации свободного хроматина.
Обзор
В данной статье представлен протокол безмаркерной визуализации молекул ДНК in situ с использованием спектроскопической одномолекулярной локализационной микроскопии (sSMLM). Благодаря использованию собственной флуоресценции ДНК данный метод позволяет осуществлять получение изображений сверхвысокого разрешения и спектральный анализ без необходимости применения внешних флуоресцентных меток, что позволяет сохранить нативные свойства молекул и избежать артефактов, связанных с маркированием.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Микроскопия сверхвысокого разрешения
- Геномный имиджинг
- Спектроскопия
- Биофизика
Теоретические основы
- Традиционная визуализация со сверхвысоким разрешением основана на флуоресцентном мечении, которое может нарушать функции клеток и приводить к погрешностям.
- Методы визуализации без использования меток необходимы для точной визуализации хроматина и ДНК с высокой плотностью на наношкале.
- Собственная флуоресценция ДНК представляет собой потенциальное решение для неинвазивной визуализации с высоким разрешением.
- Существующие методы характеризуются нестабильной плотностью мечения и могут не отражать нативные оптические свойства.
Цель исследования
- Разработать и продемонстрировать протокол измерения собственных флуоресцентных спектров молекул ДНК с помощью sSMLM.
- Обеспечить возможность безмаркерной визуализации с высоким разрешением и спектрального анализа одно- и двухцепочечной ДНК.
- Представить рабочий процесс подготовки образцов, сбора данных и спектральной калибровки.
Используемые методы
- Подготовка образцов ДНК-геля путем высушивания растворов полинуклеотидов на предметных стеклах.
- Нанесение имиджинговых буферов (бета-меркаптоэтанол или DABCO) для обеспечения стохастического фотопереключения.
- Сбор данных sSMLM, включая изображения нулевого (пространственного) и первого (спектрального) порядков.
- Спектральная калибровка с использованием массивов наноотверстий и нескольких длин волн возбуждения.
- Обработка данных в Fiji, ThunderSTORM, RainbowSTORM и с помощью пользовательских скриптов на Python для локализации и спектральной экстракции.
Основные результаты
- Успешное измерение спектров собственного излучения как одноцепочечных, так и двухцепочечных молекул ДНК.
- Демонстрация спектральных различий между типами ДНК (например, GC-альтер и A10C10) при различных длинах волн возбуждения.
- Построение калибровочной кривой для сопоставления положений пикселей с длинами волн излучения.
- Протокол обеспечивает точную локализацию и спектральный анализ без использования внешних меток.
Выводы
- Данный протокол позволяет проводить безмаркерную спектроскопическую визуализацию ДНК со сверхвысоким разрешением, сохраняя нативные молекулярные свойства.
- Он позволяет преодолеть ограничения традиционных методов маркировки, такие как нарушение структуры и неоднородная плотность меток.
- Перспективные области применения могут включать визуализацию собственной флуоресценции РНК, белков, а также безмаркерные исследования хроматина.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для отрасли
Спектроскопическая визуализация ДНК с суперразрешением с использованием собственной флуоресценции позволяет проводить безмаркерный анализ геномного материала с высоким разрешением, устраняя артефакты и несоответствия, возникающие при внешнем мечении. Эта возможность способствует раннему поиску и валидации мишеней за счет сохранения нативных молекулярных свойств и получения количественных, воспроизводимых данных. Такой подход повышает прогностическую достоверность и снижает риски биологической интерпретации на критических этапах процесса поиска и разработки.
Стратегические применения в биофармацевтических исследованиях и разработках
Ранние этапы поиска и валидация мишени
- Позволяет проводить прямой анализ структуры и последовательности ДНК без возмущений, вызванных маркировкой.
- Обеспечивает функциональную валидацию мишеней, выявляя нативные оптические свойства одно- и двухцепочечной ДНК.
- Способствует снижению механистических рисков за счет предоставления высокоточных количественных спектральных данных.
- Повышает прогностическую достоверность последующих геномных исследований и исследований хроматина.
Скрининг и разработка анализа
- Позволяет подготавливать валидированные безметочные системы ДНК для последующего использования в рабочих процессах сверхразрешения.
- Обеспечивает получение воспроизводимых количественных спектров испускания для стандартизации анализа.
- Обеспечивает возможность получения высокоплотных масштабируемых изображений, подходящих для задач скрининга.
- Позволяет надежно оценивать влияние последовательности и состава ДНК на оптические свойства.
Трансляционные и доклинические исследования
- Соответствует задачам поиска трансляционных биомаркеров за счет сохранения нативных характеристик ДНК.
- Обеспечивает непрерывность процесса от этапа поиска до доклинической валидации благодаря возможности получения изображений хроматина без использования меток.
- Снижает риск биологической ошибочности интерпретации в доклинических моделях, вызванной артефактами маркировки.
- Поддерживает возможность дальнейшего расширения области применения для исследований собственной флуоресценции РНК и белков.
Интеграция конвейера и рабочих процессов
Данный протокол интегрирован в общий процесс поиска — от раннего тестирования гипотез до идентификации ведущих соединений и доклинических исследований, поддерживая как механистические, так и трансляционные цели.
- Открывающая биология: позволяет проверять гипотезы и уточнять сигнальные пути путем измерения собственной флуоресценции ДНК и спектральных характеристик, зависящих от последовательности.
- Скрининг: обеспечивает получение воспроизводимых образцов ДНК, готовых к анализу, для высокопроизводительной визуализации сверхвысокого разрешения.
- Аналитика: предоставляет количественные пространственные и спектральные данные для надежного сравнения типов ДНК и условий эксперимента.
- Трансляционные исследования: облегчает безмаркерную визуализацию хроматина, способствуя согласованию биомаркеров и трансляционной преемственности.
- Корпоративное повторное использование: создает возможность повторного использования метода безмаркерной визуализации для различных исследований нуклеиновых кислот и хроматина.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: повышает достоверность прогнозов и снижает неопределенность механизмов при визуализации ДНК.
- Операционная ценность: стандартизирует рабочие процессы и повышает воспроизводимость за счет устранения вариабельности маркировки.
- Стратегическая ценность: улучшает принятие решений о целесообразности дальнейших действий и эффективность использования капитала за счет предоставления количественных данных без артефактов.
- Влияние на портфель: позволяет осуществлять приоритезацию с учетом рисков и развивать программы исследований геномики и хроматина.
Особенности реализации
- Требуется опыт работы в области микроскопии сверхвысокого разрешения и спектрального анализа.
- Необходим доступ к оборудованию для sSMLM, инструментам спектральной калибровки и специализированному программному обеспечению для анализа изображений.
- Требуется стандартизация протоколов подготовки образцов и обработки данных между исследовательскими группами.
- Адаптация метода для других систем нуклеиновых кислот или белков может потребовать оптимизации протокола.
- Точная фокусировка и калибровка имеют решающее значение из-за отсутствия выраженных структурных особенностей в ДНК-гелях.
