In vitro Функциональный анализ регуляторных Т-клеток: фокус на пролиферации и дифференцировке

Наша лаборатория изучала дифференцировку подмножеств Т-клеток, обмен веществ и взаимодействие. Treg влияют на перекрёстные контакты Т-клеток, поддерживают иммунный гомеостаз, что делает исследования Treg ключевыми для лечения аутоиммунных и воспалительных заболеваний. Традиционные тесты подавления Treg in vitro упускали из виду эффекты, опосредованные Treg, и дифференцировку эффекторных Т-клеток.

Этот модифицированный протокол одновременно оценивает как пролиферацию, так и поляризацию. Для начала подготовьте наивные Т-клетки, регуляторные T или Treg-обогащённые клетки, а также антиген-презентирующие клетки с неCD4-положительными клетками. Центрифугуйте наивную CD4-положительную Т-клеточную суспензию при температуре 350G в течение семи минут при четырёх градусах Цельсия и выбросьте супернатант, чтобы получить клеточную гранулу.

Разведите краситель пролиферации клеток eFluor 450 в PBS, чтобы получить концентрацию 20 микромоляров при комнатной температуре. Добавьте 0,5 миллилитра PBS на один раз на 10 к мощности семи элементов трубки. Держите трубку наклонённой примерно под углом 45 градусов и аккуратно подвешивайте клетки, поднимая и опуская 50 раз.

Затем быстро добавляйте равный объём раствора красителя для пролиферации клетки в суспензию, чтобы получить итоговую концентрацию 10 микромоляров. Держите трубку под углом 45 градусов и пипеткой, чтобы тщательно смешать их с красителем для пролиферации. Сразу же обмотайте трубку центрифугой алюминиевой фольгой, чтобы избежать освещения.

Инкубировать при комнатной температуре в течение 20 минут, аккуратно вихря каждые пять минут, чтобы предотвратить скопление клеток. Затем добавьте 10 миллилитров предварительно охлаждённой среды для культуры клеток в трубку центрифуги и аккуратно уведите клетки в вихрь, чтобы прекратить окрашивание. Затем центрифугуйте клетки и сбросьте супернатант.

Чтобы промыть клетки, добавьте пять миллилитров предварительно охлаждённой среды для культуры клеток в гранулу. Повторите центрифугирование и снова суспензируйте гранулу в пяти миллилитрах культурной среды. После подсчёта клеток центрифугуйте клетки и повторно суспендуйте в соответствующем объёме культурной среды, чтобы получить концентрацию клетки в два раза по 10 при мощности шесть клеток на миллилитр.

Держите трубку на льду. Рассчитайте количество образцов, необходимых для клеточной культуры. Подготовьте соответствующее количество клеточной культурной среды, содержащего 2,5 микрограмма на миллилитр антитела CD3 против мышей или подходящие индукционные цитокины.

Возьмите подготовленные наивные Т-клетки и клетки, обогащённые Трегом, и создайте их вихрь. Добавьте 100 микролитров CD45.2 положительных, CD4 положительных наивных Т-клеток и 100 микролитров CD45.1 положительных CD4-положительных неCD4-положительных клеток на пластину с 48 ячецами. Перенесите 100 микролитров клеток, обогащённых CD45.1, CD4 положительных, CD25-положительных Treg-обогащенных клеток в экспериментальные скважины и 100 микролитров клеточной культурной среды в контрольные колодцы.

Затем в каждую ямку 100 микролитров посевной среды с антителами CD3 против мышей и 100 микролитров культурной среды с подходящими индукционными цитокином. Добавьте PBS в оставшиеся пустые колодцы, чтобы поддерживать влажность пластины и уменьшать влияние краёв. Инкубировать пластину с 48 колодцями в инкубаторе с содержанием 5% углекислого газа при 37 градусах Цельсия в течение трёх дней.

Аккуратно пипетируйте культивированные клетки, чтобы их снова суспензировать, и перенесите суспензию клетки в 1,5-миллилитровую центрифугную трубку. Центрифугуйте клетки и удалите супернатант. Добавьте в каждую трубку 500 микролитров среды для клеточной культуры, содержащего форму-12-миристата-13-ацетат, иономицин и ингибитор транспорта белков GolgiPlug.

Мягко вооружите клетки и инкубуйте их в инкубаторе с 5% углекислого газа при 37 градусах Цельсия в течение трёх часов. После центрифугирования добавьте 50 микролитров PBS с одним тестом на зомби-жёлтый краситель и разбавленные антитела CD16 или 32 против мышей 1:100 в гранулу. Вооружите образцы и инкубуйте при комнатной температуре в темноте в течение 15 минут, чтобы разметить мёртвые клетки и заблокировать FC-рецепторы.

Центрифугуйте клетки перед тем, как выбрасывать супернатант. Добавьте в образец 50 микролитров коктейля с поверхностными антителами, уведите его в вихрь и инкубуйте при температуре 4 градусов Цельсия в темноте в течение 20 минут. Затем добавьте один миллилитр флуоресцентно-активного сортировочного буфера клеток или буфера FACS в каждую центрифугную трубку.

После центрифугирования и удаления наверху добавьте 300 микролитров раствора фиксации и проницаемости в каждую пробирку центрифуги и уведите образцы в вихрь. Инкубировать образцы при 4 градусах Цельсия в темноте в течение 20 минут. Перенесите миллилитр проницаемости и буфера для промывки в каждую трубку центрифуга, затем центрифугирование и удаление наверху.

После повторной промывки добавьте 50 микролитров коктейля с цитокиновым антителом в каждый образец и проведите вихрь образцов. Инкубировать образцы при 4 градусах Цельсия в темноте в течение 40 минут. Промывайте каждый образец с помощью одного миллилитра проницаемой жидкости и буфера для промывания.

Центрифугуйте клетки и удалите супернатант. Суспензируйте клеточную гранулу в 300 микролитрах буфера FACS. Измерять пролиферацию и дифференцировку Т-клеток-респондентов с помощью потоковой цитометрии.

Изолировать популяцию лимфоцитов среди всех клеток, чтобы исключить остатки и примеси. Выберите популяцию одной клетки среди лимфоцитов на основе сигналов рассеяния. Затем идентифицируйте популяцию живых клеток среди отдельных клеток, а затем популяцию CD4-положительных Т-клеток среди живых клеток.

Далее откройте популяцию положительных регуляторных Т-клеток CD45.1 и популяцию положительных эффекторов Т-клеток CD45.2 среди CD4-положительных Т-клеток. Затем выберите CD45.2 положительные CD4 положительные клетки с интерфероном гамма-положительным Т-хелпером 1, CD45.2 положительные CD4 положительные клетки интерлейкина-17A с положительным Т-хелпером 17 и непролиферированные CD45.2 положительные CD4-положительные Т-клетки среди CD45.2 положительных Т-клеток. Проведите сбор данных потоковой цитометрии для всех образцов.

Наконец, проанализируйте данные потоковой цитометрии с помощью программного обеспечения FlowJo, используя ту же стратегию гейтинга, что и при сборе данных потоковой цитометрии. Частота непролиферированных Т-ответных Т-клеток значительно увеличивалась при индукции как Т-хелперов 1, так и Т-хелперов 17 после совместной культуры с клетками, обогащёнными регуляторными Т-клетками. Дифференцировка CD45.2 положительных, CD4-положительных интерфероновых гамма-положительных Т-хелпер-1 клеток была значительно подавлена после совместного культивирования с регуляторными Т-клетками.

Частота CD45.2 положительных, CD4-положительных интерлейкин-17A положительных Т-хелпер-17 клеток увеличивалась при культивировании Т-клеток, обогащённых регуляторными Т-клетками. In vitro функциональный анализ Treg-клеток позволяет исследовать бионаправленные эффекты между Treg и эффекторными Т-клетками на пролиферацию и поляризацию. Самая большая сложность при выполнении этого протокола — сохранить жизнеспособность клетки, обеспечивая при этом чистоту Treg и наивных Т-клеток.

После этого процесса ELISA и другие биомедицинские анализы могут оценивать производство цитокинов и метаболических эффекторов, в то время как клетки, отсортированные FACS, позволяют проводить анализ РНК-секвенации и протеомики.