Хроматин Пробирной по правам ткани мозга

Здравствуйте, я Амиш Матан из лаборатории доктора Ша Макбериана на кафедре психиатрии Медицинского колледжа Массачусетского университета (UMass Medical School). Сегодня я продемонстрирую вам процедуру иммунопреципитации хроматина в посмертных образцах тканей головного мозга человека. Описываемая далее процедура не является очень сложной.

Наиболее захватывающим является то, что до недавнего времени исследования экспрессии в человеческом мозге ограничивались простым количественным определением мРНК и белков. Данный метод позволит нам лучше понять механизмы экспрессии генов как в здоровом, так и в патологически измененном человеческом мозге. Итак, приступим к иммунопреципитации хроматина.

Мы начали с ранее вырезанных фрагментов замороженной посмертной ткани человеческого мозга. Важно использовать защитные очки и работать в специально отведенной зоне для работы с тканями человека. При обработке этих образцов ткань мозга помещают в буфер Down Sink в объеме, в пять раз превышающем объем ткани мозга.

Когда ткань в растворе станет однородной, ее можно перенести в пробирку объемом 2 мл. После гомогенизации ткани добавьте в образец микрококальную нуклеазу из расчета 5 ед. на мл и перемешайте раствор, несколько раз прокачав его пипеткой. Затем поместите образец на лед.

Важно выполнить этот этап быстро, так как микрококальная нуклеаза способна проявлять активность даже при 4 °C. После обработки всех образцов микрококальной нуклеазой их быстро переносят в водяную баню с температурой 37 °C и инкубируют в течение семи минут.

После семиминутной инкубации мы добавляем 0,5 M EDTA до концентрации 10 мМ, чтобы остановить активность микрококальной нуклеазы. Теперь мы готовы перейти к этапу очистки. После того как образцы, содержащие нуклеосомную ДНК, были обработаны микрококальной нуклеазой, начинается процесс очистки.

Нава возьмет пробирку Falcon объемом 15 мл, в которую мы добавим 4,5 мл 0,2 мМ EDTA, 2,5 мкл 0,2 М бенадины и 4,5 мкл 0,1 М PMSF. Затем мы перенесем в эту пробирку наш образец. Далее образец инкубируют в течение одного часа на льду, перемешивая на вортексе каждые 10 минут.

По окончании часовой инкубации добавят 2.5 µL 3 M DTT. Образец снова перемешают на вортексе, затем центрифугируют в роторе с поворотными стаканами при 3 175 RCF в течение 10 минут при 4 °C. После центрифугирования супернатант разделят: 500 µL используют в качестве контрольного образца (input control), который будет содержать только геномную ДНК, а остальное распределят по двум пробиркам по 1 600 µL каждой; эти образцы будут использованы для иммунопреципитации хроматина.

Положительный контроль помещают при температуре -80 °C на ночь до дальнейшего использования. Затем к образцу в объеме одной десятой добавляют 160 µL 10 XFSB. Вместе с этим добавляют 4 µg антител.

Теперь перемешайте образцы на вортексе, затем инкубируйте их при температуре 4 °C в течение ночи. После ночной инкубации мы промоем белковые гиро-сферы, которые будут использованы для выделения нуклеосомной ДНК. Поскольку эти агарозные гранулы очень чувствительны, при работе с ними необходимо срезать кончики наконечников дозатора.

Это необходимо для того, чтобы при пипетировании микросферы имели больше свободного пространства. Теперь добавьте 1,6 мкл микросфер XFS (1X) к 245 µL белка jaguars в микроцентрифужную пробирку объемом 2 мл. Этого количества должно быть достаточно для четырех пробирок с образцом.

Затем разделите раствор микросфер по двум пробиркам объемом 2 мл и долейте в каждую до 1,6 мл одного XFSB. Перемешивайте пробирки при комнатной температуре в течение 30 секунд на ротаторе, после чего центрифугируйте их при 0,1 RCF в течение 30 секунд. После центрифугирования удалите ATE с помощью вакуума.

Добавьте 1,6 мл 1X XFSB. Снова перемешайте образцы в течение 30 секунд на ротаторе, а затем повторно центрифугируйте их при 0,1 RCF в течение 30 секунд. После центрифугирования снова удалите супернатант и объедините содержимое обеих пробирок, добавив 1,5 мл 1X XFSB.

Также добавьте 15 µL ДНК спермы. Теперь перемешивайте при комнатной температуре в течение 30 минут, а затем центрифугируйте при 0,1 RCF в течение 30 секунд. Удалите супернатант и добавьте 200 µL 1X XFSB.

Теперь добавьте по 90 µL AgroSpeeds в каждый образец осаждения хроматина, затем инкубируйте их при перемешивании на ротаторе при температуре 4 °C в течение одного часа. Для отрицательного контроля добавьте 1 mL 1X FSB в оставшийся объем AgroSpeeds и инкубируйте вместе с образцами иммунопреципитации хроматина при 4 °C в течение одного часа. Во время этой часовой инкубации можно воспользоваться возможностью, чтобы приготовить свежий буфер для элюции.

Это потребуется далее в эксперименте после часовой инкубации. Центрифугируйте образцы и отрицательный контроль при 0.1 CFS в течение 30 секунд и удалите супернандант. Затем мы промоем гранулы четырьмя различными типами промывочных растворов: низкосолевым промывочным буфером, высокосолевым промывочным буфером, раствором хлорида лития и, наконец, TE-буфером при pH 8.

Для каждого буфера, за исключением раствора хлорида лития, образцы следует перемешивать на ротаторе в течение трех минут при комнатной температуре, а затем центрифугировать при 0.1 R Cs в течение 30 секунд. Для промывки хлоридом лития перемешивайте образцы при комнатной температуре только одну минуту. После каждой промывки удалите супернатант с помощью вакуума.

Теперь мы готовы приступить к элюции наших образцов. Для начала этапа элюции в каждый образец добавляют 250 µL свежеприготовленного элюирующего буфера. Образцы перемешивают в ротаторе в течение 15 минут при комнатной температуре, затем центрифугируют при 0.4 RCF в течение одной минуты.

Теперь перенесите супернатант в пробирку объемом 2 мл оранжевого цвета. Затем добавьте 250 µL элюционного буфера в каждый образец. Снова перемешайте все образцы на вортексе вручную в течение нескольких секунд.

Затем перемешайте образцы на вортексе в течение 15 минут, после чего центрифугируйте пробирки. Установите 16 RCF на четыре минуты и перенесите супернатант в ту же пробирку объемом 2 мл. Для гидролиза белка в образцах сначала добавьте по 10 µL 0,5 M DTT, 25 µL 0,8 M Tris-HCl с pH 6,5 и 2,5 µL протеиназы K в концентрации 10 mg/mL в каждый образец иммунопреципитации хроматина.

К каждому контрольному образцу добавьте 15 µL лизисного буфера и 2,5 µL протеиназы K в концентрации 10 mg/mL. Инкубируйте как исходные образцы, так и образцы иммунопреципитации хроматина при 52 °C не менее трех часов. По завершении трехчасовой инкубации можно приступать к экстракции фенол-хлороформом.

После трехчасовой инкубации в каждый образец добавляют 500 µL фенилхлориформа. Эта процедура проводится в вытяжном шкафу, так как фенилхлориформ является органическим химическим веществом, которое опасно как при попадании на кожу, так и при вдыхании. Затем все образцы перемешивают на вортексе в течение нескольких секунд и центрифугируют при 13 RCF в течение пяти минут.

В пробирках должны присутствовать две фазы. Поскольку нас интересует содержимое верхней фазы, мы извлечем ее и перенесем в микроцентрифужную пробирку объемом 2 мл. Затем к каждому образцу добавляют смесь 2 µL гликогена и 50 µL 3 M ацетата натрия, а также 1,375 мл 100% этанола.

Все образцы тщательно перемешивают на вортексе и помещают при температуре -80 °C на ночь. После инкубации в течение ночи образцы переносят на лед для размораживания. Затем их центрифугируют при 15 RCF в течение 10 минут при температуре 4 °C.

После центрифугирования осторожно слейте супернатант, стараясь не задеть осадок на дне пробирки. Затем к каждому образцу добавьте 1 мл холодного 75% этанола и переверните пробирки четыре-шесть раз. После этого пробирки повторно центрифугируют при 18 RCF в течение пяти минут при температуре 4 °C.

Супернатант снова удаляют, после чего осадки оставляют высыхать на воздухе. После высыхания осадки растворяют в 50 µL 4 мM раствора HCl с pH 8 и хранят при температуре -80 °C до дальнейшего использования. Итак, я продемонстрировал вам, как проводить иммунопреципитацию хроматина на замороженных образцах посмертного мозга человека.

И помните, что при выполнении данной процедуры крайне важно соблюдать все необходимые меры предосторожности при работе с тканями человеческого мозга. Анализы иммунопреципитации хроматина могут быть использованы для более глубокого понимания экспрессии генов как в здоровом, так и в пораженном заболеванием человеческом мозге. На этом всё. Спасибо за просмотр и удачи в ваших экспериментах.