Генерация костного мозга мышей Производные дендритных клеток для использования в 2-фотонных изображений

Подготовка дендритных клеток из костного мозга обеспечивает отличный источник антигенпрезентирующих клеток, которые могут быть использованы для экспериментов in vitro или in vivo при двухфотонной визуализации иммунной системы. Введение антигенпрезентирующих клеток позволяет изучать антигенспецифические межклеточные взаимодействия в контексте живого лимфатического узла. В данной работе мы демонстрируем метод стерильного выделения костного мозга и методы культивирования для получения зрелых дендритных клеток.

Кроме того, мы прослеживаем развитие дендритных клеток с первого по одиннадцатый день. Это развитие представлено на статичных изображениях и в видеозаписях из инкубатора, созданных с помощью системы Incucyte от Scent Technologies. В завершение мы демонстрируем, как дендритные клетки, полученные из костного мозга, представляют антиген COV T-клеткам OT-II в дренажном лимфатическом узле.

Здравствуйте, я Мелани Мэтью из лаборатории Майки Хейлена в близлежащем Калифорнийском университете. Вы когда-нибудь задумывались о том, что происходит внутри в процессе пробирования, пока растут ваши клетки? Сегодня?

В рамках нашего протокола мы продемонстрируем вам использование некоторых приборов на месте. Система Inky позволяет отслеживать рост клеточных культур в вашем инкубаторе. В данном протоколе мы покажем вам, как изолировать и подготовить дендритные клетки костного мозга мыши.

Первым делом я покажу вам, как извлечь бедренные кости и выделить костный мозг. Сначала зафиксируйте животное булавками. Затем смочите животное 70% ethanol. Сделайте первый разрез вдоль средней линии тела животного.

Затем сделайте разрез по внутренней стороне ноги, как я показываю. Чтобы обнажить мышечную ткань над бедренной костью, вам следует отодвинуть мышцу и захватить массивную бедренную кость диссекционным пинцетом. Удерживая кость пинцетом, переместитесь вниз по кости и сделайте первый разрез чуть ниже сустава.

Затем продвигайте ножницы вдоль бедренной кости и сделайте разрез максимально близко к телу. Это может привести к небольшому кровотечению, особенно если вы перережете бедренную артерию. При извлечении бедренной кости крайне важно сохранить целостность кости.

Как видно здесь, концы кости не были обрезаны или повреждены. После извлечения бедренной кости удалите излишки тканей и поместите кость в небольшую чашку с нашей средой PMI. При удалении дополнительных тканей следите за тем, чтобы бедренная кость не пересыхала.

На данном этапе бедренные кости следует перенести в чашку с 70% ethanol и поместить на лед на 5–10 минут. В данном видео мы продолжим работу на лабораторном столе, однако на этом этапе эксперимента все манипуляции должны проводиться в ламинарном шкафу для культуры тканей.

После замачивания костей в этаноле их можно перенести в более широкую чашку со стерильной средой для удаления костного мозга. Теперь можно приступить к извлечению и ресуспендированию костного мозга. Наполните инсулиновый шприц стерильной средой и отложите его для дальнейшего использования.

Захватите кость стерильным пинцетом. Удерживая её над небольшим планшетом для сбора отходов, отсеките эпифизы или концы кости с обеих сторон. Введите инсулиновый шприц в один из концов кости и вымойте костный мозг из кости в 15 мл среды.

Промойте кость еще один или два раза, пока весь костный мозг не будет полностью вымыт. После того как костный мозг будет удален, кость станет почти полностью белой. Поместите очищенную кость в емкость для отходов и повторите процедуру с другой бедренной костью.

После завершения этого этапа осторожно измельчите любые фрагменты костного мозга, которые не распались в процессе промывки, чтобы создать суспензию одиночных клеток. Это потребует от 5 до 10 минут пипетирования. Поместите суспензию одиночных клеток в коническую пробирку объемом 50 мл, промойте планшет не менее трех раз 10 мл среды.

Каждый раз центрифугируйте клетки, удалите среду и ресуспендируйте клетки, энергично и резко постучав пальцами по дну пробирки. Для удаления эритроцитов (RBCs) мы проводим водный лизис. Другим методом удаления эритроцитов является лизис с использованием хлорида аммония.

Оба метода были описаны в предыдущих видеостатьях JoVE. Выделение CD4-положительных T-клеток из лимфатических узлов мышей с использованием системы очистки Miltenyi Biotec (JoVE, выпуск 9) и получение фактора роста T-клеток из цитокинов крыс (JoVE, выпуск 10).

После удаления эритроцитов вы готовы приступить к культивированию. Прежде чем я перейду к культивированию дендритных клеток, я хочу познакомить вас с системой Incucyte. Система Incucyte позволяет отслеживать рост клеточных культур непосредственно в инкубаторе, чтобы мы могли наблюдать за их поведением или отклонениями от нормы.

После подготовки культуры поместите ее в лоток соответствующего размера и закройте систему Incucyte. Затем на компьютере установите временной интервал, выберите лунки, которые необходимо визуализировать, и запустите сбор данных системой Incucyte. Видео, представленные в данном протоколе, демонстрируют изменения морфологии дендритных клеток in vitro.

Эти видео были экспортированы непосредственно из программы сайта Incus. По мере развития дендритных клеток с первого по одиннадцатый день можно наблюдать истинное изменение морфологии, поскольку они увеличиваются в размере и приобретают фенотип дендритных клеток. После лизиса и удаления эритроцитов клетки промывают в среде для первичных дендритных клеток и высевают из расчета 5 миллионов на мл.

Эти клетки следует первоначально культивировать в среде для первичного культивирования дендритных клеток, а затем переносить в среду для вторичного культивирования DC, дополненную 40 ng/mL IL-4 и 100 ng/mL TNF-α. Эти цитокины способствуют развитию зрелых дендритных клеток, которые по своим характеристикам напоминают дендритные клетки, полученные из моноцитов. Теперь я покажу вам, как выглядят культуры в процессе развития и как поддерживать их с течением времени.

После посева клеток дендритные клетки можно культивировать в течение 72 часов до первой смены среды. Вот так выглядит типичная культура сразу после посева клеток в первый день. А здесь представлен вид клеток при большем увеличении.

На третий день видно, что клетки начали прикрепляться к планшету, но еще не приобрели классический фенотип дендритных клеток. На четвертый день удалите среду и добавьте 10 мл свежей среды для первичных DC путем аспирации среды. На четвертый день мы удалим лимфоциты и любые другие неадгезивные клетки.

Теперь образцы можно вернуть в инкубатор еще на три дня, так что в общей сложности после первоначального посева пройдет семь дней. Вот как выглядит типичная культура. По такому виду можно определить, что настало время для пассирования и перепосева клеток.

На седьмой день дендритные клетки удаляют с планшета, аспирируя среду, после чего добавляют 300 мМ стерильного EDTA и инкубируют в течение пяти минут. Затем планшет неоднократно промывают, удерживая его под углом 45 градусов и дозируя раствор EDTA по задней стенке планшета. Эту процедуру проводят в течение нескольких минут, чтобы обеспечить удаление всех адгезивных дендритных клеток.

Клетки собирают в коническую пробирку объемом 50 мл и дважды промывают вторичной средой для культивирования DC. Затем клетки ресуспендируют и высевают из расчета 5 миллионов клеток на планшет. Свежевысеянные дендритные клетки седьмого дня быстро оседают на дно планшета, прикрепляются и начинают распластываться.

Как видно из видео с сайта Zichy, данная запись была сделана в инкубаторе в течение двух дней, чтобы продемонстрировать развитие дендритных клеток от начального перепосева на седьмой день до начала девятого дня. Морфологически дендритные клетки могут быть активированы антигенным пульсом путем добавления 2 µg/mL LPS и 100 µg/mL OVA для использования с T-клетками, очищенными из мышей OT-II, которые имеют OVA-специфические CD4-положительные T-клетки. Если вы используете другой антиген, важно убедиться, что вы применяете оптимальную концентрацию антигена для пульсации ваших дендритных клеток. Здесь OVA и LPS добавляются в первичную среду таким образом, чтобы конечная концентрация LPS составляла 2 µg/mL в 20 mL, а OVA — 100 µg/mL в 20 mL.

На данном снимке представлена типичная культура дендритных клеток на 10-й день. По этому изображению видно, что морфология клеток полностью соответствует характеристикам антигенпрезентирующих клеток. Вам следует всегда проверять процент CD 11 C-положительных дендритных клеток с помощью проточной цитометрии.

Это необходимо для того, чтобы получить относительно чистую культуру дендритных клеток для использования в ваших экспериментах. Здесь мы используем систему IncySite от SEN Instruments для мониторинга активации дендритных клеток, подвергнутых воздействию LPS и пульс-обработке антигеном на 10-й день. Данное видео охватывает 24-часовой период непосредственно после добавления LPS и пептида; в ходе записи дендритные клетки становятся более активными, и наблюдаются явные морфологические изменения.

После активации дендритных клеток путем импульсного воздействия антигена их можно снова собрать, инкубировав с 300 millimolar EDTA и промыв планшет. Затем центрифугируйте клетки, дважды промойте их 50 mils среды RPMI для удаления остатков антигена и пометьте подходящим красителем для отслеживания клеток. В данном эксперименте я буду проводить визуализацию клеток в паховом лимфатическом узле.

Нам потребуется ввести от двух до 5 миллионов дендритных клеток дермально в область бока мыши, показанной здесь. Затем мы выждем 24 часа, чтобы дендритные клетки мигрировали в обучающий лимфатический узел. В данном видео дендритные клетки помечены CMF two hc — синим красителем для отслеживания клеток.

Вы можете видеть дендритные клетки, взаимодействующие с меченными Т-клетками, которые специфичны по отношению к антигену волина. Эти Т-клетки мечены ccf SE. Также для молекулярных зондов можно использовать C-M-T-M-R или любой другой краситель из серии cell tracker. Это ранняя стадия активации Т-клеток, взаимодействующих с дендритными клетками.

Поскольку они антигенно-специфичны, видно, что T-клетки прикрепляются к отросткам меченых синим цветом dcs. На этом завершается наш протокол, демонстрирующий подготовку и использование дендритных клеток костного мозга мыши в эксперименте по двухфотонной визуализации. Спасибо за просмотр и удачи в ваших собственных экспериментах.