Генерация костного мозга мышей Производные дендритных клеток для использования в 2-фотонных изображений

Получение дендритных клеток из костного мозга является отличным источником антигенпрезентирующих клеток, которые могут быть использованы для экспериментов in vitro или in vivo в двух боттонных визуализациях иммунной системы. Введение антигенпрезентирующих клеток позволяет изучать антиген-специфические клеточные взаимодействия в контексте живого лимфатического узла. Здесь мы демонстрируем стерильную изоляцию костного мозга и методы культивирования для получения зрелых дендритных клеток.

Кроме того, мы следим за развитием дендритных клеток с первого по 11-й день. Эта разработка отражена в виде неподвижных изображений и в видеороликах инкубатора, сделанных с использованием ароматических технологий incus site. Наконец, мы показываем дендритные клетки, полученные из костного мозга, представляющие антиген ОТ двух Т-клеток в зеркальном лимфатическом узле.

Привет, я Мелани Мэтью в лаборатории Мики Халена в Калифорнийском университете неподалеку. Задумывались ли вы когда-нибудь, что происходит внутри во время зонда, пока ваши клетки растут? Сегодня?

В рамках нашего протокола мы покажем вам, как использовать S некоторые инструменты на месте. Чернильный сайт позволяет отслеживать рост клеточных культур в инкубаторе. В этом протоколе мы покажем вам, как изолировать и препарировать клетки, полученные и сгруппированные из костного мозга мыши.

Итак, первое, что я собираюсь показать вам, как это сделать, это удалить бедренные кости и изолировать костный мозг. Сначала прикрепите животное. Далее намочите животное 70%-ным этанолом. Сделайте первый разрез по средней линии животного.

Затем разрежьте ногу изнутри, как я вам показываю здесь. Чтобы обнажить мышечную ткань над бедренной костью, вы должны иметь возможность оттянуть мышцу в сторону и захватить большую бедренную кость с помощью рассекающего пинцета. Удерживая кость пинцетом для вскрытия, двигайтесь вниз по кости и сделайте первый надрез чуть ниже сустава.

Затем проведите ножницами вверх по длине бедренной кости и сделайте ее разрезанной как можно ближе к телу. Это может привести к небольшому количеству крови, особенно если вы перережете бедренную артерию. При удалении бедренной кости чрезвычайно важно, чтобы кость оставалась неповрежденной.

Как видно здесь на концах кости не было разрезано и не нарушено. После того, как бедренная кость будет удалена, отрежьте всю дополнительную ткань и поместите бедренную кость в небольшую чашку с нашим фильтрующим материалом PMI. При удалении дополнительной ткани следите за тем, чтобы бедренная кость не пересыхала.

На этом этапе бедренные кости следует переложить в чашку, содержащую 70% этанола, и поместить на лед на пять-10 минут. Для целей этого видео мы продолжим работу на лабораторном столе. Однако на данном этапе эксперимента все должно быть перенесено в капюшон для культуры тканей.

После того, как кости были пропитаны этанолом, вы можете переместить их в большую миску со стерильной средой для удаления костного мозга. Теперь мы готовы извлечь и снова суспензировать костный мозг. Наполните инсулиновый шприц стерильной средой и отложите в сторону для последующего использования.

Возьмитесь за кость стерильным пинцетом. Держите его над небольшой тарелкой для выброшенных кусочков и срежьте эпифиз или концы костей с каждой стороны. Поместите инсулиновый шприц в одну сторону кости и промойте костный мозг из кости в 15 мил среды.

Промойте кость еще один или два раза, пока весь костный мозг не будет промыт. Как только костный мозг будет вымыт из кости, он будет почти полностью белым. Положите чистую кость в форму для мусора и повторите процесс с другой бедренной костью.

Как только это будет завершено, аккуратно разрушьте все части костного мозга, которые не были разбиты в процессе промывки, чтобы образовалась одноклеточная суспензия. Для этого потребуется от пяти до 10 минут пипетирования. Поместите одноклеточную суспензию в коническую трубку 50 мил, промойте пластину не менее трех раз 10 мил среды.

Каждый раз поворачивайте клетки вниз, удаляйте среду и снова суспендируйте клетки, крепко и быстро проводя пальцами по дну трубки. Чтобы удалить эритроциты или эритроциты, мы проводим лизис воды. Еще одним методом удаления эритроцитов является лизис хлорида аммония.

Оба метода были описаны в предыдущих видеостатьях JoVE. Выделение CD четырех положительных Т-клеток из лимфатических узлов мыши с использованием препарата Milan max purification JoVE issue nine и препарата фактора роста Т-клеток из крысиных цитов JoVE. Выпуск 10.

После удаления эритроцитов вы теперь готовы к культуре. Итак, прежде чем я проведу вас через культуру клеток дендри, я хотел бы познакомить вас с сайтом инкусов. Сайт incus позволит вычесть прогнозируемый рост клеточной культуры в инкубаторе, чтобы мы могли наблюдать за тем, как они ведут себя или плохо себя ведут.

После того, как культура установлена, вы помещаете ее в лоток соответствующего размера и задвигаете место посева. Затем на своем компьютере вы просто устанавливаете временной интервал, а затем выбираете скважины, которые вы хотели бы изобразить, и позволяете чернильному сайту собирать данные за вас. Фильмы покажут вам этот протокол, продемонстрируют изменения морфологии дендритных клеток in vitro.

Эти видео были экспортированы прямо из программы сайта Incus. По мере того, как дендритные клетки развиваются с первого по 11-й день, вы можете наблюдать истинные изменения морфологии по мере того, как они увеличиваются и приобретают фенотип дендритных клеток. После лизирования, эритроцитов и их удаления, клетки промываются в первичной дендритной клеточной среде и покрываются в дозе 5 миллионов на мил.

Эти клетки должны быть первоначально культивированы в первичных средах для культивирования дендритных клеток, а затем мы культивируем их во вторичных средах DC, которые дополняются 40 нанограммами на миллион IL и 100 нанограммами на миллион TNF альфа. Эти цитокины помогут в развитии зрелых дендритных клеток, которые напоминают дендритные клетки, полученные из моноцитов. Итак, теперь я собираюсь показать вам, как выглядят культуры по мере их развития и как поддерживать их с течением времени.

После того, как вы наложили пластины на клетки, вы можете культивировать дендритные клетки в течение 72 часов до первой смены среды. Вот как будет выглядеть ваша типичная культура сразу после того, как вы нанесете пластину на клетки в первый день. А вот взгляните на клетки.

На третий день можно увидеть, что клетки начали прилипать к пластине, но не приняли классический фенотип дендритных клеток. На четвертый день удалите среду и добавьте 10 мил свежей первичной среды постоянного тока. На четвертый день мы удалим лимфоциты в любых других неадгезивных клетках.

Теперь вы можете вернуться в инкубатор еще на три дня, через семь дней после первоначального размещения. Вот как будет выглядеть ваша типичная культура. Вы можете сказать, что пришло время разделить ячейки и перевернуть их.

На седьмой день дендритные клетки удаляют из планшета путем аспирации среды, а затем добавляют 300 миллимолярных стерильных ЭДТА и инкубируют их в течение пяти минут. Затем планшет многократно промывается, удерживая под углом 45 градусов и пипетируя раствор ЭДТА к тыльной стороне планшета. Это делается в течение нескольких минут для того, чтобы вы удалили все прилипшие дендритные клетки.

Клетки собираются в коническую пробирку 50 миллиметровой плотности и дважды промываются вторичной средой постоянного тока. Затем элементы ресуспендируются и покрываются из расчета 5 миллионов клеток на пластину. Только что отреставрированные семь дендритных клеток быстро оседают на дно пластины, прилипают и начинают распространяться.

Как вы можете видеть на видео сайта Zichy, это видео было снято в инкубаторе в течение двух дней, чтобы показать вам развитие дендритных клеток от первоначального восстановления, сделанного на седьмой день, до начала девятого дня. Морфология дендритных клеток может быть активирована в антигенном импульсе путем добавления двух микрограммов на LLPS здесь со ста микрограммами для яйцеклеток для использования с Т-клетками, выделенными из OT двух мышей, которые имеют специфичные для яйцеклеток CD четыре положительных Т-клеток. Если вы используете другой антиген, важно убедиться, что вы используете оптимальную концентрацию антигена для пульсации ваших ДКС здесь, ОВ и ЛПС добавляются в первичные среды таким образом, что конечная концентрация ЛПС составит два микрограмма на милл на 20 милов, а яйцеклетка будет сто микрограммов на мил на 20 милов.

Вот фотография того, как выглядит типичная культура дендритных клеток на 10-й день. На этой фотографии вы можете видеть, что морфология очень типична для антигенпрезентирующих клеток. Вы всегда должны проверять процент CD 11 C положительных дендритных клеток по факсу.

Это необходимо для того, чтобы убедиться, что у вас есть относительно чистая культура дендритных клеток для использования в ваших экспериментах. Здесь мы используем чернильный сайт от инструментов SEN для мониторинга активации дендритных клеток, которые были обработаны ЛПС в антигенном импульсе на 10-й день. Это видео охватывает 24-часовой период сразу после добавления ЛПС и вала и пептида, и в нем дендритные клетки становятся более активными, и происходят некоторые очевидные морфологические изменения.

После того, как дендритные клетки активируются в антигенном импульсе, вы можете снова собрать их путем инкубации с 300 миллимолярными ЭДТА и промывки планшета. Теперь поверните клетки вниз, дважды промойте 50 мил среды RPMI, чтобы удалить любой дополнительный антиген, и пометьте их соответствующим краем для отслеживания клеток. В этом эксперименте я буду визуализировать клетки пахового лимфатического узла.

Нам нужно будет ввести от 2 до 5 миллионов дендритных клеток в дермально в боковую область мыши, показанную здесь. Затем мы даем 24 часа, чтобы дендритные клетки вернулись к тренировочному лимфатическому узлу. В этом видео дендритные клетки помечены CMF two hc, красителем для отслеживания синих клеток.

Вы можете видеть, как дендритные клетки взаимодействуют с мечеными Т-клетками, которые являются антиген-специфичными для волина. Эти Т-клетки помечены ccf SE. Вы также можете использовать C-M-T-M-R или любой другой краситель для отслеживания клеток для молекулярных зондов. Это ранняя стадия активации Т-клеток, взаимодействующих с ДКС.

Поскольку они специфичны к антигенам, вы можете видеть, что Т-клетки прилипают к усикам синих ДК. На этом мы завершаем наш протокол, демонстрирующий получение и использование дендритных клеток костного мозга мышей в эксперименте с визуализацией двух боттонов. Спасибо за просмотр и удачи в собственных экспериментах.