Техническая демонстрация полного генома массива Сравнительный геномной гибридизации

Следующая короткая презентация представляет собой видео, демонстрирующее протокол гибридизации для массива 27 K sub megabase ting. Этот массив или интеллектуальный массив состоит из 26 946 последовательно расположенных обратных клонов, напечатанных на одном слайде. Они расположены в двух экземплярах, что в общей сложности составляет 54 000 элементов на слайде, напечатанном в области 18 на 54 миллиметра.

Полученные данные сопоставимы с олигомассивами высокой плотности, не требуя интерпретации данных биоинформатикой. Одним из основных преимуществ использования большого массива вставок, такого как обратные клоны, является то, что он позволяет использовать всего 100 нанограммов образца ДНК без амплификации. Это позволяет анализировать различные образцы, такие как ДНК из крови, замороженных тканей, отсортированных клеток и материала FFPE.

Интеллектуальная матрица доказала свою эффективность в клинических условиях. В Агентстве по борьбе с раком Британской Колумбии анализ нескольких образцов пациентов легко вписывается в среднюю рабочую неделю. Для цитогенетики.

Большинство шагов, используемых в массиве CGH, аналогичны обычному CGH или fish. Позволяет быстро внедрить протокол в существующие лаборатории. Качество ДНК оказывает наибольшее влияние на результаты в массивах.

Гибридизация CGH, низкое качество или загрязненная ДНК отрицательно повлияют на включение PSI в продукт, что приведет к тусклым изображениям или шуму в данных. Спектрофотометр NanoDrop является отличным инструментом для оценки качества ДНК до гибридизации. Чтобы количественно определить набор ДНК, NanoDrop для измерения нуклеиновой кислоты и режим для измерения DNA 50 blank, NanoDrop с 1,5 микролитрами того же раствора, что и ваш ресуспендированный образец.

В данном случае это водная Трис. Было показано, что ЭДТА оказывает потенциальное негативное воздействие на инкорпорацию PS D. Снимите пустую салфетку салфеткой Кима и добавьте 1,5 микролитра образца и запишите концентрацию образца.

Показания два 60 на два 80 на NanoDrop являются хорошим показателем качества ДНК, где соотношение 1,8 является оптимальным. Метод двойного соотношения два 60 на два 80 и два 60 на два 30 обеспечивает еще лучший способ определения чистоты ваших образцов. NanoDrop отображает кривую, представляющую поглощение относительно длины волны.

Гладкая кривая без пиков свидетельствует о хорошем качестве: протрите ДНК и промойте NanoDrop водой и салфеткой Кима, или, если образец предельный, снимите образец с пьедестала. Этот протокол оптимизирован для обработки образца от 100 до 400 нанограммов. 200 нанограмм — целевое количество для ДНК хорошего качества Для маркировки образца требуются следующие реагенты и оборудование.

Буфер SCI три SCI пять случайных ER 10 раз DNTP смесь эталонная ДНК стерильная вода 0,2 мкл стерильные ПЦР-пробирки ледяной тепловой блок при 100 градусах Цельсия инкубатор при 45 градусах Цельсия. Установите одну реакционную пробирку для референсной ДНК и одну реакционную пробирку. Образцы ДНК будут помечены как sci-fi и SCI 3 соответственно.

В исследовательских условиях мы предпочитаем использовать CY 3 для нашего образца ДНК, поскольку он более устойчив к разложению озона. Соедините воду и буфер канала ДНК с образцом и повторите для получения эталонной ДНК. В нашей лаборатории мы объединяем буфер 10 раз со случайным оптимусом.

Для создания пятикратного раствора добавьте стерильную воду до общего объема 17 микролитров. Перенесите трубки в нагревательный блок, денатурируйте в течение пяти минут при температуре 100 градусов Цельсия. Переложите сразу на лед.

Добавьте четыре микролитра в 10 раз в смесь DNTP. Добавьте боковые глаза. Добавьте два микролитра SCI с тремя мечеными DCTP к образцу ДНК.

Добавьте два микролитра меченного научно-фантастическим DCTP к эталонной ДНК. Добавьте 2,5 микролитра канала и перемешайте. Раствор может быть как ручным смешиванием, так и вихревым.

Кратковременно опустите раствор на дно пробирки с помощью быстрого импульса в настольной центрифуге. Переложите в духовку и выдерживайте при температуре 37 градусов в течение ночи. Время гибридизации в течение ночи может быть скорректировано в диапазоне от 14 до 24 часов без негативного влияния на процесс маркировки.

Чтобы вписать лабораторный график с помощью колонки MicroCon YM 30, добавьте в колонку 100 микролитров, пойманных 1D NA. Будьте осторожны, чтобы не прикоснуться к мембране с застрявшим кончиком пипетки. Известно, что расхождения ДНК от партии к партии имеют место даже при покупке у крупных дистрибьюторов.

Перед использованием рекомендуется приобретать и тестировать большие партии. Теперь для гибридизации каждого образца будет две пробирки, одна окрашена в синий цвет и одна окрашена в красный. Соедините пробирки для каждого образца и перемешайте с помощью пипетирования.

Затем перенесите весь раствор на мембрану MicroCon. Поместите колонку в прилагаемую пробирку MicroCon и вращайте при температуре 13 000 G в течение 10 минут. Колонка MicroCon представляет собой колонку исключения размера и захватывает ДНК с включенными боковыми красителями и позволяет невключенным красителям промываться через мембрану.

Чтобы промыть остатки неинкорпорированных нуклеотидов или боков, добавьте 200 микролитров стерильной дистиллированной воды в мембрану. Вращайте снова при 13 000 G в течение 10 минут. Выбросьте пробирку и добавьте 45 микролитров раствора гибридизации в верхнюю часть колонки концентратора MicroCon.

Решение для гибридизации, которое мы используем, - это Dig Easy от Roche Scientific, в раствор также можно добавить пять микролитров общей спермы сельди. Традиционно это использовалось для блокировки неконкурентного прилегания к поверхности слайда. Появление новых связующих веществ позволило устранить этот этап.

Тем не менее, иногда его добавляют для увеличения вязкости гибридизационного раствора. Переверните столбец MicroCon и поместите его в новую пробирку с маркировкой. Вращайте трубку при 3000 G в течение трех минут.

Раствор будет собираться на дне новой пробирки. 1,5 микролитра раствора будут использоваться для количественной оценки SD Incorporation. Установите NanoDrop To для анализа микрочипов, пусто.

NanoDrop с 1,5 микролитрами копания. Легкий буфер для гибридизации. Измерьте заготовку с помощью NanoDrop.

Показания должны быть равны нулю. Снимите пустую салфетку салфеткой kim и добавьте 1,5 микролитра образца меры и запишите включение образца. NanoDrop даст вам моль PICA на микролитр образцов включений S3 и научно-фантастических красителей с приведенными ниже включениями.

Следует считать, что три оле на микролитр имеют слишком мало четверок Fluor Чтобы продолжить, NanoDrop отобразит график зависимости поглощения от длины волны. Должны быть видны два пика, по одному на каждый из боковых глаз протрите и очистите NanoDrop With water и салфеткой kim. Поместите чехол на предметную грелку или нагревайте блок, предварительно нагрейте до 45 градусов Цельсия для поддержания температуры гибридизации.

Нанесите 42 микролитра раствора щупа на крышку размером 22 на 60 миллиметров. Следите за тем, чтобы в растворе не было пузырьков воздуха. Быстрый способ удалить упрямый пузырь — взять свежую крышку и лопнуть пузырь с острым углом.

Направьте ползунок на защитное стекло и раствор щупа. Опустите один край предметного стекла, чтобы обеспечить контакт с раствором для гибридизации. Продолжайте опускать один край до тех пор, пока защитное накладка не прикрепится к предметному стеклу с поверхностным натяжением.

Переверните предметное стекло. Поместите предметное стекло в кассету для гибридизации, предварительно прогрейте до 45 градусов Цельсия и добавьте 10 микролитров воды в нижнюю канавку для контроля влажности. Этот шаг следует практиковать, так как копатель легко кристаллизуется при более низких температурах и оставит фон на предметном стекле.

Это особенно важно, когда раствор находится на предметном стекле, так как это очень тонкий слой жидкости. На этом этапе закройте кассету и выдерживайте от 36 до 40 часов при температуре 45 градусов Цельсия. Снятие предметного стекла с кассеты для гибридизации имеет решающее значение.

Выкапывается, легко кристаллизуется при комнатной температуре. Горку следует немедленно погрузить, а чехол снять в моющем растворе. Все моющие растворы должны быть предварительно приготовлены и иметь pH семь ненейтральных pH, которые могут ухудшить работу боковых глаз.

Подогрейте раствор для стирки до 45 градусов Цельсия. Добавьте примерно 60 миллилитров промывочного раствора в банку Copeland перед открытием камеры гибридизации. Откройте камеру.

Снимите предметное стекло пинцетом и добавьте предметное стекло в раствор для мытья. Не снимая крышку, подождите от 10 до 20 секунд и извлеките ее пинцетом. Он должен был упасть с горки.

Это важный шаг, так как он предотвращает кристаллизацию буфера Dig Easy, а также снижает вероятность царапин на затворе за счет механического удаления стекла крышки. Промойте предметное стекло три раза в растворе для мытья. По одной минуте с агитацией.

Промойте предметное стекло три раза. В растворе для стирки не должно быть остатков пузырьков от паспорта безопасности, видимых после последней стирки. Оставьте предметное стекло в моющем растворе до готовности к центрифуге.

Центрифуга в 50-миллилитровой пробирке Falcon при 700 G в течение одной минуты. Перед использованием убедитесь, что трубка Falcon сухая. Немедленно отсканируйте предметное стекло, так как интенсивность сигнала со временем будет уменьшаться.

В зависимости от уровня окружающего озона, каждый сканер индивидуален, но есть некоторые общие рекомендации, которым следует следовать. Для визуализации слайдов. Уровень озона в окружающей среде имеет решающее значение в процессе сканирования.

Научно-фантастический кристалл чувствителен к озону и быстро разрушается в течение длительного времени сканирования. Было показано, что пять частей на миллиард озона влияют на S пять. Это эквивалентно легкому загрязнению дорожного движения в ясный день.

Для регистрации уровня окружающего озона рекомендуется использовать озометровые приборы. Для каждого канала S3 и SCI five создается отдельное изображение. Каналы могут быть сбалансированы путем изменения экспозиции, времени, возбуждения, входного сигнала или чувствительности сканирования сканера.

Теперь эти изображения готовы к анализу.