Изображениями создания эффектов памяти Т-клеток в ухо после индукции приемных DTH
14 августа 2008 г.
Здесь мы показываем, способ индуцирования и записи хода замедленного типа, гиперчувствительность (DTH) реакции у крыс уха. Это сопровождается демонстрацией подготовки крысы ткани уха в течение двух-фотонной визуализации эффектор / память ответа Т-клеток.
Здравствуйте, меня зовут Мелани Мэтью. Я аспирантка лаборатории Майки Холлинса на кафедре физиологии и биофизики Калифорнийского университета в Ирвайне. Сегодня вместе с доктором Кристин Битон мы покажем вам, как визуализировать популяцию эффекторных или Т-клеток памяти, отвечающих на стимул, в ушной раковине крысы.
Доктор Кристин Битон сначала индуцирует реакцию гиперчувствительности замедленного типа (ГЗТ) в ушной раковине крысы. Затем мы перейдем к визуализации уха крысы in situ с помощью двухфотонной микроскопии. Два дня назад я ввела в гипертокс-крысу линии Lewis Т-клетки, специфичные к овальбумину и меченные GFP.
Сегодня я проведу эксперимент на той же крысе, используя ее ушные раковины. В правое ухо я введу альбумин, а в левое — PBS.
Доза вводимого мной альбумина составляет 20 micrograms в 20 microliter. Используемый мной альбумин представляет собой смесь в соотношении один к одному альбумина, меченного Texas Red, и немеченого альбумина. Это правая часть, на которой я продемонстрирую процесс инъекции.
Поскольку я правша, я снял перчатку с левой руки, чтобы иметь возможность поместить один палец под ухо, а другой над ним для растягивания кожи; это позволяет мне точно видеть положение иглы и вводить ее между двумя слоями кожи в области ушной раковины, где она очень тонкая. Для этого я использую иглы 27 gauge, так как они предельно тонкие и подходят для данной процедуры.
Таким образом, если я поверну его, вы определенно увидите, куда попал Texas red, а куда — PBS. Сейчас прошло 42 часа после введения антигена, и я воспользуюсь пружинным микрометром для измерения толщины ушной раковины. Я измерю оба уха: правое, в которое вводили альбумин, и левое, которое не подвергалось воздействию; разница в толщине позволит нам оценить интенсивность воспаления.
О, 62 0 60 0 61, 0 60 или 58 или 57 или 57. А в другом ухе 4 49 4 55 4 48.4 47 4 46, 4 50. Здравствуйте. Итак, Кристин Битон только что передала нам крысу, которую она убрала после измерения ответа на ДТГ.
Мы перенесли их сюда на льду. Это левое ухо крысы. Сейчас мы находимся в лаборатории Яна Паркера и проводим двухфотонную микроскопию.
Теперь я подготовлю ушные раковины для двухфотонной визуализации in situ. Я начну с подготовки одного из ушей крысы в области основания ушной раковины. Ткань здесь значительно толще, и присутствуют волоски, которые могут помешать, если я начну делать надрезы сразу.
Для начала я просто обрежу часть шерсти. Я аккуратно придерживаю ухо. Если удерживать ткань между большим и указательным пальцами, ею гораздо проще управлять.
Я предпочитаю этот способ использованию пинцета, потому что с пинцетом мне сложнее почувствовать состояние ткани, а мы всегда опасаемся ее повредить. Нам важно чувствовать, что именно мы делаем, поэтому мне больше нравится использовать пальцы.
Здесь виден слой дермы, который отделяется в этой области уха крысы. В процессе удаления волос мне удалось осторожно подрезать дерму, и она просто начала отслаиваться. Для этого используются очень маленькие препаровальные ножницы, обычные качественные изогнутые ножницы.
Не следует прокалывать ткань; можно двигаться от основания ушной раковины к ее верху, осторожно иссекая часть дермального слоя. Для визуализации нам не потребуется большое окно. Этой области будет достаточно, чтобы получить качественные изображения клеток, инфильтрирующих ткань.
Как видите, у нас здесь сохранились целые кровеносные сосуды у основания уха и практически по всей длине до самого кончика. Вся эта область будет очень подходящей для визуализации реакции гиперчувствительности замедленного типа (DTH). Поэтому я приступлю к вырезанию этого обнаженного участка ткани, чтобы получить небольшой фрагмент, который мы сможем приклеить к предметному столику нашего сканера.
Просто сделайте разрез здесь, переверните образец. Я могу разрезать здесь. Теперь у нас есть подходящий небольшой фрагмент ткани, который мы можем подготовить для визуализации на нашем двухфотонном микроскопе.
Это небьющиеся пластиковые покровные стекла, которые мы вырезаем по размеру нашего образца ткани. Затем с помощью клея Bet Bond мы фиксируем ткань на этих стеклах. После этого мы закрепляем небьющиеся пластиковые покровные стекла на столике для имиджинга in situ, используя силиконовую смазку.
Я возьму этот небольшой кусочек ткани уха; он немного изогнут, поэтому мне придется расправить его, когда я буду приклеивать. Это не идеально, но сработает. Возьмите одно из таких покровных стекол и обрежьте его, примерно оценив размер уха; вырезайте чуть больше, чем, по вашему мнению, потребуется.
Для закрепления ткани на покровном стекле мы используем безопасный для тканей суперклей Betlong. Мы приобретаем его у компании 3M и просто наносим несколько капель этого клея на покровное стекло.
Я не хочу использовать слишком много клея. Также необходимо убедиться, что он распределен равномерно. Поэтому я возьму небольшой кусочек линзовой салфетки и с помощью её угла распределю клей по этому покровному стеклу.
Я добавлю немного дополнительного клея, и как только он соприкоснется с водой, он затвердеет. Поэтому нужно быть очень осторожными с образцом ткани. Я возьму за уголок ткани здесь, который мы, скорее всего, не будем снимать, так как он находится на изогнутой части.
Я немного просушу его. Нижнюю часть, просто промокнуть фильтровальной бумагой, чтобы она стала полностью сухой. Затем я прикоснусь краем этого образца ткани уха крысы к покровному стеклу.
И в тех местах, где я прикоснулась, образец должен застыть мгновенно. Остальную часть я просто немного разровняю, осторожно нажав по краям. Надеюсь, в итоге мы получим хороший кадр для визуализации.
Теперь я приступлю к отверждению клея путем погружения образца в среду. Чтобы клей не попал на поверхность ткани, мы переворачиваем ее верхней стороной вниз и медленно погружаем сначала одним углом в резервуар со средой; после этого образец должен надежно зафиксироваться, и мы сможем провести визуализацию в камере для прижизненной визуализации тканей. Теперь мы закрепим на предметном столике подготовленный для визуализации in situ фрагмент ткани печени.
Перед нами фрагмент ткани с силиконовой смазкой на нижней стороне; мы осторожно помещаем его в поток среды. Теперь за счет силиконовой смазки образец закреплен на нижней части предметного столика. Регулируем поток среды, расположив температурный датчик непосредственно рядом с образцом.
Теперь перейдем к фокусировке. Для этого я включу наш фокусирующий свет, яркий свет. Теперь я возьму объектив 20x и опущу его в камеру.
Убедитесь, что он не касается ткани. Посмотрите в окуляр и сфокусируйтесь на ткани ушной раковины. Вот она.
Здесь видны автофлуоресцирующие зеленые волосяные фолликулы в дермальном слое ушной раковины крысы. Эти волосяные фолликулы окружены плотным слоем коллагена. Этот слой мы удаляем для двухфотонной визуализации Т-клеток памяти.
Автофлуоресцентные волосяные фолликулы и яркий коллаген верхнего слоя дермы будут заслонять изображение. Итак, здесь вы видите, что АПК поглотили волин, конъюгированный с Texas red, и они расположены вдоль этих синих коллагеновых волокон. Коллагеновые волокна окрашены в синий цвет благодаря генерации второй гармоники, которую мы получаем при двухфотонной визуализации вдоль коллагеновых волокон.
Мы имеем дело с высокоподвижными т-клетками. Они перемещаются вдоль коллагеновых волокон и взаимодействуют с АПК. Таким образом, в этом видео вы видели, как доктор Кристин Битон индуцирует адаптивную ДГР у крыс линии Льюис.
Затем мы продемонстрировали вам подготовку уха для визуализации, реактивные T-клетки памяти эффекторного типа, ухо крысы и наши методы двухфотонной микроскопии для проведения данной процедуры.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данной статье представлен метод индукции и регистрации реакций гиперчувствительности замедленного типа (ГЗТ) в ушной раковине крысы с последующей подготовкой тканей уха крысы для двухфотонной визуализации ответов Т-клеток.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Иммунология
- Нейронаука
- Биофизика
Теоретическая часть
- Замедленная гиперчувствительность (ЗГС) представляет собой ключевой иммунный ответ.
- Понимание динамики Т-клеток имеет решающее значение для иммунологических исследований.
- Двухфотонная микроскопия позволяет осуществлять визуализацию клеточных ответов in situ.
- Модели на крысах часто используются для изучения иммунных ответов.
Цель исследования
- Для индукции и регистрации реакций ЗГС в ушных раковинах крыс.
- Для визуализации популяций эффекторных и Т-клеток памяти.
- Для углубления понимания поведения Т-клеток in vivo.
Используемые методы
- Индукция реакции гиперчувствительности замедленного типа (ГЗТ) в ткани уха крысы.
- Инъекция Т-клеток, меченных GFP.
- Двухфотонная микроскопия для визуализации.
- In situ анализ ответов Т-клеток.
Основные результаты
- Успешная индукция ГЗР в модели ушной раковины крысы.
- Визуализация популяций Т-клеток с помощью двухфотонной микроскопии.
- Представление о динамике иммунного ответа in vivo.
- Продемонстрированный метод может быть применен в дальнейших иммунологических исследованиях.
Выводы
- Данный метод представляет собой надежный подход к изучению реакций ГЗТ.
- Двухфотонная визуализация эффективна для наблюдения за поведением Т-клеток.
- Это исследование вносит вклад в понимание иммунных ответов.
Часто задаваемые вопросы
Значимость для отрасли
Данный метод позволяет напрямую визуализировать динамику эффекторных Т-клеток памяти при тканеспецифическом иммунном ответе, что способствует механистическому снижению рисков при валидации иммунологических мишеней. Благодаря сочетанию адаптивной индукции DTH с двухфотонной визуализацией, метод предоставляет количественные, пространственно разрешенные данные о мотильности Т-клеток и их взаимодействиях с антигенпрезентирующими клетками. Такой подход повышает прогностическую достоверность на ранних этапах поиска за счет установления связи между поведением клеток и функциональными иммунными исходами в системе, релевантной для конкретного заболевания.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Ранний поиск и валидация мишени
- Научная ценность: позволяет проверять терапевтические гипотезы путем визуализации рекрутирования и активации CCR7-эффекторных T-клеток памяти in vivo.
- Операционная ценность: обеспечивает функциональную валидацию иммуномодулирующих мишеней посредством прямого наблюдения за взаимодействиями T-клеток с антигенпрезентирующими клетками (АПК).
- Прогностическая ценность: помогает в приоритизации портфеля препаратов путем корреляции паттернов подвижности T-клеток с интенсивностью воспаления в системе, релевантной для заболевания.
Скрининг и разработка анализа
- Научная ценность: Подготовка стандартизированных эксплантатов тканей для обеспечения согласовой и воспроизводимой визуализации динамики иммунных клеток.
- Практическая ценность: Создание платформы для количественного анализа, такого как отслеживание клеток, частота их взаимодействий и глубина инфильтрации.
- Масштабируемость: Использование минимально обработанной ткани ушной раковины, совместимой с рабочими процессами визуализации высокого разрешения.
Трансляционные и доклинические исследования
- Научная ценность: Сохраняет иммунологическую релевантность за счет поддержания нативной архитектуры тканей и межклеточных взаимодействий в процессе визуализации.
- Практическая ценность: Связывает этап поиска с доклинической валидацией, обеспечивая возможность лонгитюдного отслеживания иммунного ответа в одной и той же модели.
- Снижение рисков: Уменьшает механистическую неопределенность при идентификации перспективных соединений-лидеров, предоставляя прямые доказательства связывания с мишенью в ткани.
Интеграция конвейеров и рабочих процессов
Данный метод вписывается в континуум открытий — от проверки гипотезы о мишени до доклинической валидации, что позволяет итеративно совершенствовать иммуномодулирующие кандидаты на основе анализа поведения иммунных клеток в режиме реального времени.
- Фундаментальная биология: позволяет проверить гипотезы путем визуализации ответов Т-клеток на антигенный вызов в контролируемой модели ГЗР.
- Скрининг: обеспечивает получение готовых к анализу препаратов тканей со стандартизированной толщиной и методом монтирования для воспроизводимой двухфотонной визуализации.
- Аналитика: позволяет получить количественные данные, включая скорость движения клеток, длину трека и пространственное распределение относительно коллагена и АПК.
- Трансляционные исследования: обеспечивает преемственность от этапа поиска до доклинических исследований за счет использования одной и той же модели крысы как для индукции, так и для визуализации.
- Корпоративное повторное использование: создает универсальную платформу визуализации, применимую для множества иммунологических мишеней и антигенспецифических линий Т-клеток.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: обеспечивает снижение механистических рисков посредством прямой визуализации функции эффекторных Т-клеток памяти в тканях.
- Практическая ценность: стандартизирует подготовку тканей и условия визуализации для повышения воспроизводимости результатов в различных исследованиях.
- Стратегическая ценность: позволяет принимать решения о целесообразности дальнейшей разработки (go/no-go), связывая динамику Т-клеток с воспалительными исходами в прогностической модели.
- Влияние на портфель: обеспечивает продвижение проектов с учетом рисков путем подтверждения воздействия мишени на поведение иммунных клеток перед проведением дорогостоящих исследований in vivo.
Особенности реализации
- Требуется опыт в области адаптивного переноса T-клеток, индуцирования реакции замедленной гиперчувствительности (ЗГС) и двухфотонной микроскопии.
- Зависит от наличия доступа к двухфотонным микроскопам с функцией генерации второй гармоники для визуализации коллагена.
- Необходимо соблюдение стандартизированных протоколов работы с тканями для обеспечения единообразного закрепления и сохранения жизнеспособности образцов во время визуализации.
- Требуется адаптация метода подготовки ушной раковины при применении к другим типам тканей или моделям заболеваний.
- Ограничено необходимостью использования антигенспецифических линий T-клеток и соответствующих контролей для дифференциации специфического воспаления от неспецифического.
