Изображениями создания эффектов памяти Т-клеток в ухо после индукции приемных DTH

Привет, меня зовут Мелани Мэтью. Я учусь в аспирантуре лаборатории Мики Холлинса в Калифорнийском университете в Ирвайне на кафедре физиологии и биофизики. И сегодня, вместе с доктором Кристин Битон, мы собираемся показать вам, как мы визуализируем ответный эффект или популяцию Т-клеток памяти в ухе крысы.

Доктор Кристин Битон сначала вызовет гиперчувствительность DTH замедленного типа в ухе крысы. А затем мы перейдем к визуализации уха крысы in situ с помощью двух фотомикроскопов. Два дня назад я ввел GFP, меченный альбумин-специфическими Т-клетками в гипер-клетках Льюиса.

И сегодня я собираюсь бросить вызов той же крысе в ухо. Итак, в правое ухо я собираюсь ввести альбумин. И в левое ухо я просто собираюсь ввести немного PBS.

Доза альбумина, которую я ввожу, составляет 20 микрограммов на 20 микролитров. И альбумин, который я использую, представляет собой смесь один к одному из Texas Red с маркировкой альбумина и без маркировки альбумина. Вот справа, на котором я собираюсь показать вам, как я собираюсь вводить инъекции.

Так что у меня левая рука, я правша. Итак, я снял перчатку левой рукой, чтобы иметь возможность поместить один палец под ухо, а другой выше, чтобы растянуть кожу так, чтобы я мог точно видеть, где я нахожусь, и войти между двумя слоями кожи в воздухе, которые очень тонкие. Поэтому я использую иглы 27 калибра, чтобы внутрь было что-то очень тонкое.

Так что, если я поверну его с ног на голову, вы определенно увидите, куда ушел техасский красный и куда ушел PBS. Итак, прошло 42 часа после испытания, и я собираюсь использовать подпружиненный микрометр для измерения толщины уха. Итак, я собираюсь измерить оба уха, правое ухо, которое было поражено альбумином, и левое ухо, которое не было повреждено, и разница в толщине даст нам представление об интенсивности воспаления.

О, 62 0 60 0 61, 0 60 или 58 или 57 или 57. И другое ухо 4 49 4 55 4 48,4 47 4 46, 4 50. Hi.So Кристин Битон только что подарила нам крысу, которую она удалила после измерения реакции на DTH.

Мы перевезли их сюда на льду. Это левое ухо от крысы. И сейчас мы здесь, в лаборатории Яна Паркера, проводим двухфотонную микроскопию.

Итак, я собираюсь подготовить эти уши к двухфотонной визуализации in situ. Итак, я собираюсь подготовить одно из крысиных ушей здесь, у основания уха. Ткань намного толще, и у нас торчат волосы, которые будут немного неряшливыми, если я просто начну их резать.

Итак, первое, что я собираюсь сделать, это просто отрезать часть этих волос. Я просто нежно держу ухо. Мой палец значительно облегчает контроль над тканью, когда вы держите его между большим и указательным пальцами.

Я предпочитаю использовать щипцы, потому что щипцы, я просто не могу так легко чувствовать, что делает ткань, и мы всегда беспокоимся о том, чтобы повредить ткань. Поэтому мы хотим иметь возможность чувствовать, что мы с этим делаем. Так что мне просто нравится использовать свои пальцы.

Это дермальный слой, отслаивающийся отсюда в ухе крысы. Поэтому, когда я подстригала часть волос, мне удалось аккуратно подстричь некоторые из этих дерм, которые просто отслаиваются. Для этого есть очень маленькие ножницы для препарирования, просто красивые изогнутые ножницы.

Вы не хотите колоть ткань и можете двигаться вверх от основания уха к верхушке, просто аккуратно срезав часть дермального слоя. Так что нам не нужно очень большое окно для визуализации. Этой области будет достаточно, чтобы получить несколько красивых изображений клеток, проникающих в ткань.

Итак, вы можете видеть, что у нас есть несколько неповрежденных кровеносных сосудов у основания уха и практически до кончика уха. Вся эта область будет действительно хороша для визуализации DTH. Итак, я собираюсь пойти дальше и вырезать тот кусок ткани, который я обнажил, чтобы сделать небольшой кусочек ткани, который мы можем приклеить к нашей сцене визуализации.

Так что просто сделайте здесь надрез, переверните его. Я могу вырезать здесь. У нас есть небольшой кусочек ткани, который мы можем подготовить на нашем двухфотонном эндоскопе для визуализации.

Это небьющиеся пластиковые покровные листы, которые мы обрезаем по размеру нашей ткани. А затем мы устанавливаем на них ткань с помощью бонда. А затем мы закрепляем эти небьющиеся пластиковые защитные стекла с помощью силиконовой смазки на нашем сцене визуализации на месте.

Я собираюсь взять этот маленький кусочек воздушной ткани, у него есть небольшая кривизна, поэтому мне придется расплющивать его, когда я приклеиваю его. Не идеально, но получится. Итак, вы просто берете одну из этих покровных полос и режете ее, как бы оцениваете размер вашего уха и просто режете немного больше, чем вы думаете.

Чтобы закрепить нашу салфетку на чехле, слипаемся. Мы используем безопасный для тканей суперклей под названием bet long. Мы получаем его от 3М и просто наносим пару капель на нашу обложку.

Я не хочу иметь слишком много. И вы также должны быть уверены, что он распределен равномерно. Итак, я просто возьму небольшой лист бумаги для линз и использую его уголок, чтобы закрепить клей на крышке.

Собираемся немного увеличить количество лишнего клея и как только этот клей коснется воды, он затвердеет. Поэтому вы должны быть очень осторожны с образцом ткани. Итак, я собираюсь захватить тканевый уголок здесь, который мы, вероятно, не будем изображать, потому что он находится на изогнутой части.

Я собираюсь немного подсушить его. Нижняя его часть, только на бумаге для объектива, чтобы она вся высохла. И я собираюсь коснуться уголка уголка, этой крысиной ушной салфетки к покровному листу.

И он должен немедленно затвердеть там, где я к нему прикоснулся. Остальное, я просто собираюсь немного выровнять, слегка надавливая на него, на края. Так что, надеюсь, у нас получится хорошая рамка для изображения.

Итак, теперь я собираюсь отверждать клей, окунув его в фильтрующий материал. Поэтому, чтобы предотвратить попадание клея на ткань, мы переворачиваем ее вверх дном и медленно погружаем сначала на один угол в резервуар со средой, и она должна хорошо прилипнуть, и мы можем визуализировать ее в нашей камере визуализации тканей. Итак, теперь мы собираемся установить кусок ткани, к которому мы готовились к визуализации на месте, кусок пивной ткани на сцене.

Итак, вот наш кусок салфетки с силиконовой смазкой на дне, и мы просто аккуратно помещаем его в поток среды. Теперь к нижней части сцены прилипла силиконовая смазка. Увеличьте яркость потока среды с помощью нашего датчика температуры, расположенного рядом с ним.

А теперь мы сосредоточимся. Поэтому я собираюсь включить наш фокус, новый свет, нашу яркую кожуру. Итак, я возьму наш объектив с 20 кратным увеличением и опустю его в камеру.

Следите за тем, чтобы он не касался ткани. Посмотрите через окуляр и сосредоточьтесь на ткани нашего уха. И вот оно.

Здесь вы видите аутофлуоресцентные зеленые волосяные фолликулы в дермальном слое уха крысы. Вокруг этих волосяных фолликулов находится плотный слой коллагена. Это слой, который мы удаляем для Т-фотонной визуализации ячеек памяти Т-фектора.

Аутофлуоресцентные волосяные фолликулы будут затенять изображение так же, как и яркий коллаген верхнего дермального слоя. Итак, вы можете видеть, что у нас есть АПК, которые впитали техасский красный конъюгированный волин, и они расположены вдоль этих синих коллагеновых волокон. Коллагеновые волокна имеют синий цвет из-за генерации второй гармоники, которую мы получаем при фотонной визуализации вдоль коллагеновых волокон.

У нас есть высокоподвижные tcell. Они ползают вверх и вниз по коллагеновым волокнам и взаимодействуют с АПК. Итак, в этом видео вы видели, как доктор Кристин Битон индуцировала адоптивный DTH у крысы Льюиса.

А затем мы показали вам нашу подготовку уха к визуализации, чувствительные клетки памяти Т-эффектора, а также ухо крысы и наши два фотонных метода для этого.