Изоляция нейронов ядра из человеческих тканей мозга Посмертные

Для изучения взаимодействий хроматина и ДНК, которые регулируют нейрон-специфичную экспрессию генов в человеческом мозге, прежде всего необходимо получить чистую популяцию нейронных ядер. Ткань мозга человека посмертно гомогенизируют, а общую фракцию ядер выделяют с помощью центрифугирования в градиенте плотности. Затем ядра маркируют нейрон-специфичными антителами, выделяют их методом проточной сортировки и, наконец, концентрируют путем ультрацентрифугирования.

Здравствуйте, я Аниш Матан из лаборатории доктора Шерон Макбериан на кафедре психиатрии Медицинского колледжа Массачусетского университета. Сегодня я продемонстрирую вам процедуру выделения ядер нейронов из посмертных тканей головного мозга человека. Итак, приступим.

Для каждого образца ядер, подлежащего сортировке, возьмите одну тысячу миллиграммов замороженной посмертной ткани мозга. Из такого количества после флуоресцентной сортировки можно получить около 5 миллионов нейрональных ядер. Чтобы начать экстракцию ядер, поместите 250 миллиграммов ткани мозга в пробирку, содержащую пять мл лизирующего буфера, и поставьте ее на лед.

После размораживания ткани подвергните ее гомогенизации в течение одной минуты на льду. После гомогенизации перенесите гомогенизированную ткань в прозрачную ультрацентрифужную пробирку объемом 15 мл и поместите пробирку на лед. Повторите процедуру гомогенизации для остальной части ткани.

Затем осторожно внесите пипеткой 9 мл раствора сахарозы на дно ультрацентрифужных пробирок для создания градиента концентрации таким образом, чтобы раствор гомогенизированной ткани находился над раствором сахарозы. Теперь взвесьте ультрацентрифужные пробирки, чтобы обеспечить их балансировку во время ультрацентрифугирования. При необходимости отрегулируйте вес, добавив лизирующий буфер в верхний слой. После взвешивания поместите пробирки в ультрацентрифугу с ротором SW 28 и центрифугируйте при 107163.6 RCF в течение 2,5 часов при температуре 4 °C.

После завершения центрифугирования аспирируйте супернатант, а также слой дебриса, находящийся в градиенте концентрации. Будьте осторожны, чтобы не задеть осадок на дне пробирки, содержащий ядра. Затем добавьте по 500 µL 1XPBS к каждому осадку и выдержите на льду в течение 20 минут.

Через 20 минут повторно суспендируйте осадки, перемешивая их пипеткой вверх и вниз. Инкубация на льду способствует постепенному самостоятельному растворению осадка, что облегчает ресуспендирование ядер и тем самым снижает уровень стресса, воздействующего на ядра. Затем перенесите ресуспендированные ядра в центрифужные пробирки объемом 2 мл.

Перенесите раствор нуклеиновых кислот из двух ультрацентрифужных пробирок в каждую микроцентрифужную пробирку и снова поместите образцы на лед. Поскольку экстракция нуклеиновых кислот завершена, я перехожу к этапу иммуноокрашивания для изоляции нейрональных ядер методом FACS. Образец, содержащий ядра, будет инкубировать с смесью для иммуноокрашивания, состоящей из первичных и вторичных антител, а также блокирующего раствора. Для приготовления смеси для иммуноокрашивания добавьте 1,2 µL нейроспецифических антител NeuN к 300 µL 1X PBS. Затем добавьте 100 µL блокирующей смеси, содержащей 0,5% BSA и 10% нормальной сыворотки козы в 1X PBS.

Наконец, добавьте один микролит вторичного антитела LOR 4 88. Также подготовьте иммуноокраску для образца отрицательного контроля для данной смеси для иммуноокрашивания. Исключите первичный антитело new end и замените его 1,2 микролитрами 1XPBS.

Теперь перемешайте смеси для иммуноокрашивания на вортексе и инкубируйте их в течение пяти минут при комнатной температуре в темноте. Пока смеси окрашиваются, подготовьте образцы ядер для отрицательного контроля: перенесите 20 µL суспендированных ядер в пробирку объемом 2 мл, содержащую 980 µL 1X PBS. Также подготовьте неокрашенный контроль, содержащий только раствор ядер и PBS.

Теперь перенесите 20 µL ядер в другую пробирку и доведите объем снова до 1 mL с помощью 1X PBS. Затем поместите все образцы обратно на лед. К этому моменту приготовление смесей для иммуноокрашивания должно быть завершено.

Добавьте 401 µL смеси в соответствующий образец для инкубации. В образец с ядрами была добавлена смесь, содержащая как новые антитела, так и LOR 4 88. В образец отрицательного контроля была добавлена смесь, содержащая только вторичные антитела LOR 4 88, в то время как в образец контроля без окрашивания иммуноокрашивающие реагенты не добавлялись.

Затем перенесите образцы в ротор и инкубируйте их в темноте при вращении в течение 45 минут. По завершении 45-минутной инкубации я отнесу образцы в центр проточной цитометрии Медицинского колледжа Университета Массачусетса для проведения сортинга с флуоресцентной активацией. Во время транспортировки в центр образцы следует содержать на льду и в темноте. В центре проточной цитометрии образцы сначала фильтруют через фильтр с порами 40 микрон, после чего их пропускают через прибор в течение нескольких минут, поддерживая низкую температуру.

Это выполняется для получения предварительных данных перед сортировкой. Неокрашенный контрольный образец позволяет определить уровень отрицательной флуоресценции. На основании этой информации отрегулируйте чувствительность прибора к флуоресценции.

Окрашенный контроль используется для контроля флуоресценции. Любой фоновый шум, вызванный флуоресценцией, на данном этапе позволяет установить соответствующие гейты, необходимые для сортировки. Для сортировки образцов используются несколько различных гейтов.

Ниже приведены типичные данные для первого гейта. На данной диаграмме факс-анализа представлен репрезентативный образец после настройки гейта. Первый гейт распознает паттерны клеточного дебриса и жизнеспособных ядер на основе сочетания таких параметров, как флуоресценция и общий визуальный опыт.

Ось X представляет прямое светорассеяние, которое соответствует относительному размеру, а ось Y — боковое светорассеяние, которое отражает внутреннюю сложность, такую как гранулярность. Первый гейт также позволяет получить представление о размере различных ядер, обнаруженных в нашем образце. Это позволяет отделить клеточный детрит от самих ядер; ниже представлены типичные данные второго гейта.

На этой диаграмме фактического сигнала показан пример второго гейта, который позволяет сортировать ядра по отдельности, отсеивая любые агрегаты. Этот гейт учитывает разницу во времени прохождения ядер через лазер. Ядра-агрегаты обычно проходят через него дольше.

Данный параметр очень важен, так как наличие агрегатов может повлиять на чистоту выборки, поскольку некоторые флуоресцентные ядра могут быть связаны с не флуоресцентными. Наконец, представлены типичные данные из третьего гейта. Этот гейт настроен на определенную длину волны флуоресценции, соответствующую флуорофору, входящему в состав нашего вторичного антитела.

На данной диаграмме рассеяния по оси x представлен уровень флуоресценции, а по оси y — детектор глубокого красного канала PECY 7. Такие дот-блот-графики обеспечивают лучшую визуализацию по сравнению с одноцветной гистограммой. Использование SCADA позволяет сортировать и отделять нейрональные ядра, положительные по новому маркеру, от ненейрональных ядер, отрицательных по этому маркеру.

После выбора всех гейтов ядра сортируются в одну пробирку с XPBS. Как только весь образец пройдет через этап сортировки, проверьте чистоту сортировки, пропустив аликвоту отсортированного образца через прибор. Вот пример оптимального результата.

Здесь сравните образец до сортировки, содержащий смешанную популяцию ядер, с отсортированной популяцией Eloqua, в которой была удалена большая часть негативных ядер. Обратите внимание, что процент чистоты основан на количестве событий, которые загрязняют образец согласно установленным гейтам. Имейте в виду, что при первом прогоне образца через прибор может произойти частичное выцветание, что приведет к снижению интенсивности сигнала; для компенсации этого эффекта могут потребоваться некоторые корректировки.

После сортировки образца приступайте к обработке ядер. Для этого возьмите 10 мкл отсортированного образца и добавьте два мкл раствора сахарозы, 50 µL 1 M хлорида кальция и 30 µL 1 M ацетата магния. Если объем отсортированного образца составляет менее 10 мкл, доведите его объем до 10 мкл, добавив 1X PBS, или соответствующим образом скорректируйте количество добавляемых реагентов.

Затем несколько раз переверните пробирку с образцом и поместите её на лёд на 15 минут. По истечении 15 минут центрифугируйте образец в роторе с угловым разделением при 1 786 RCF в течение 15 минут при температуре четырех градусов. После центрифугирования осторожно аспирируйте супернатант, чтобы не потревожить белый осадок на дне пробирки.

Затем растворите осадок в 200 мкл соответствующего раствора, необходимого для предыдущих экспериментов. В данном случае мы растворяем осадок в буфере для последующего эксперимента с использованием чипа. Затем ресуспендируйте осадок, перемещая жидкость вверх и вниз с помощью дозатора.

На данном этапе ядра можно перенести в пробирку меньшего размера и поместить в морозильную камеру при температуре -80 °C до дальнейшего использования. Итак, я продемонстрировал вам способ выделения нейрональных ядер из посмертных тканей головного мозга человека. С полученными ядрами можно провести ряд различных анализов, таких как иммунопреципитация хроматина.

При выполнении данной процедуры важно помнить о необходимости постоянно держать образцы на льду, так как ядра не зафиксированы и могут деградировать при длительном воздействии температуры. Кроме того, важно работать с тканями человека в соответствии со стандартами биологической безопасности уровня 2 или выше. На этом всё.

Благодарим за просмотр и желаем успехов в ваших экспериментах.