Изоляция нейронов ядра из человеческих тканей мозга Посмертные

Чтобы изучить взаимодействия хроматиновой ДНК, которые управляют экспрессией нейронных специфических генов в человеческом мозге, сначала необходимо получить чистую популяцию нейронных ядер. Посмертная ткань мозга человека гомогенизируется и целые ядра выделяются с помощью центрифугирования с градиентом плотности. Затем ядра помечаются нейрональными специфическими антителами, выделенными с помощью проточной сортировки, и, наконец, концентрируются с помощью ультрацентрифугирования.

Здравствуйте, я Аниш Матан из лаборатории доктора Шэрон мак Бариан здесь, на факультете психиатрии Медицинской школы Университета Массачусетса. Сегодня я покажу вам процедуру выделения ядер нейронов из посмертной ткани мозга человека. Итак, приступим.

Чтобы отсортировать каждый образец ядра, начните с тысячи миллиграммов замороженной постсмертельной ткани мозга. С этим количеством можно получить около 5 миллионов ядер нейронов после сортировки, активированной флуоресценцией. Чтобы начать экстракцию ядер, поместите 250 миллиграммов мозговой ткани в пуховый пух, содержащий пять мил буфера для лизиса, и поместите его на лед.

Как только ткань оттает, она оттает в течение одной минуты, находясь на льду. После употребления перенесите гомогенизированную ткань в прозрачную ультрацентрифужную пробирку объемом 15 мил, а затем положите пробирку на лед. Повторите эту гомогенизацию для оставшейся ткани.

Затем осторожно нанесите пипеткой девять мил раствора сахарозы на дно ультрацентрифужных пробирок, чтобы установить градиент концентрации таким образом, чтобы гомогенизированный тканевый раствор находился поверх раствора сахарозы. Теперь утяжелите ультрацентрифужные пробирки, чтобы убедиться, что они сбалансированы во время ультрацентрифугирования. Внесите любые коррективы в вес, добавив буфер для лизиса в верхний слой После взвешивания пробирок поместите их в ультрацентрифугу с использованием образцов ультрацентрифуги с ротором SW 28 при температуре 107163,6 RCF на 2,5 часа при четырех градусах.

Как только центрифугирование будет завершено, отсадите отстойник, а также слой мусора, обнаруженный на градиенте концентрации. Будьте осторожны, чтобы не потревожить гранулу на дне трубки, в которой находятся ядра. Далее добавьте 500 микролитров одного XPBS в каждую гранулу и дайте ей постоять на льду в течение 20 минут.

Через 20 минут суспензируйте гранулы путем пипетирования вверх и вниз. Инкубация на льду позволяет гранулам немного раствориться самостоятельно, что облегчает ресуспендирование ядер, тем самым уменьшая количество стресса, который испытывают ядра. Затем перенесите реактивную суспензию и ядра в две мил-центрифужные пробирки.

Соедините нуклеиновый раствор из двух ультрацентажных пробирок с каждой микроцентроцентрической пробиркой и снова поместите образцы на лед. Теперь, когда нуклеиновая экстракция завершена, я перейду к этапу иммуноокрашивания, чтобы изолировать ядра нейронов по факту, сортируя образец, содержащий ядра, будет инкубироваться с иммуноокрашивающей смесью, состоящей из первичного и вторичного антител, а также блокирующих звеньев для получения иммуноокрашивающей смеси от 1,2 микролитра нейронального специфического антитела от нового N до 300 микролитров одного XPBS. Затем добавьте сто микролитров блокирующей смеси, которая содержит 0,5% BS, A и 10% обычной кодовой сыворотки в одном XPBS.

Наконец, добавьте один микролитр вторичного антитела под названием LOR 4 88. Также приготовьте иммунокраситель для отрицательного контрольного образца для этой смеси иммунокрасителей. Исключите новый конец первичного антитела и замените его 1,2 микролитрами одного XPBS.

Теперь вихревые иммуноокрашивающие смеси и инкубируйте их в течение пяти минут при комнатной температуре в темноте, пока окрашивающие смеси инкубируются. Подготовить образцы контрольных ядер для отрицательного контрольного образца Eloqua 20 микролитров ядра резуса в пробирку диаметром два мила, содержащую 980 микролитров одного XPBS. Также приготовьте неокрашенный контроль, который содержит только раствор ядер и PBS.

Теперь Eloqua поместите 20 микролитров ядер в другую пробирку и увеличьте объем обратно до одного мила с помощью одного XPBS. Затем поместите все образцы обратно на лед. К настоящему времени приготовления иммуноокрашивающих смесей завершены.

Инкубируя добавляют 401 микролитр смеси в соответствующий образец. В образец ядер получалась смесь, содержащая как новые, так и LOR 4 88. Отрицательный контрольный образец получали смесь, содержащую только вторичное антитело LOR 4 88, в то время как к неокрашенному контрольному образцу иммунокраситель не добавляли.

Далее перенесите образцы в колдрон и поверните их в темноте в течение 45 минут. Теперь, когда 45-минутная инкубация завершена, я провожу образцы в центр проточной цитометрии Университета Массачусетса для сортировки, активированной флуоресценцией. Во время транспортировки в центр ядра образцы должны храниться на льду и в темноте. В керне проточной цитометрии образцы сначала фильтруются через фильтр 40 микрон, а затем пропускаются через прибор в течение нескольких минут при хранении в холоде.

Это делается для того, чтобы получить некоторые предварительные данные перед сортировкой. Неокрашенный контроль устанавливает степень отрицательной флуоресценции. На основе этой информации отрегулируйте чувствительность аппарата к флуоресценции.

Мерцающий контроль используется для борьбы с гриппом. Любой фоновый шум из-за отсутствия флуоресценции на этом этапе устанавливает соответствующие стробы, необходимые для сортировки. Для сортировки образцов используется несколько различных затворов.

Вот некоторые типичные данные для первого вентиля. На этой диаграмме анализа факса показана репрезентативная выборка после регулировки стробов. Первый вентиль распознает паттерны обломков и жизнеспособных ядер на основе комбинации настроек, таких как флуоресценция и общий визуальный опыт.

Ось X представляет прямой разброс, который соответствует относительному размеру, в то время как ось Y учитывает разброс сайта, который учитывает внутреннюю сложность, такую как гранулярность. Первый вентиль также может дать представление о размерах различных ядер, обнаруженных в нашем образце. Это позволяет отделить обломки от самих ядер, и вот некоторые типичные данные со второго затвора.

На этой факсимильной диаграмме показан пример второго вентиля, который позволяет сортировать ядра по отдельности, отбрасывая при этом любые агрегаты. Этот вентиль учитывает различия в продолжительности времени, которое требуется ядрам для прохождения через лазер. Те агрегаты, которые являются агрегатами, обычно проходят дольше.

Этот параметр очень важен, так как включение агрегатов может повлиять на чистоту, так как некоторые флуоресцентные ядра могут быть связаны с нефлуоресцентными. Наконец, вот типичные данные с третьего затвора. Этот затвор настроен на определенную длину волны флуоресценции, соответствующую длине волны флуорона, обнаруженного в нашем вторичном антителе.

На этой факсимильной диаграмме вы видите уровень флуоресценции по оси x и детектор с красным каналом, PECY 7 по оси Y. Эти точечные блоттинги дают лучшее визуальное представление по сравнению с гистограммой одного цвета. Размещение SCADA позволяет сортировать и отделять новые и положительные нейронные ядра от новых и отрицательных ненейрональных ядер.

После того, как все вентили выбраны, ядра сортируются в один XPBS. После того, как весь образец прошел через сортировку фактов, проверьте чистоту сорта, пропустив через прибор Eloqua отсортированного образца. Вот пример оптимального результата.

Здесь сравните предсортировочную выборку, которая содержит смешанную популяцию ядер, с отсортированной Eloqua, которая устранила большую часть отрицательных ядер. Обратите внимание, что проценты чистоты основаны на количестве событий, которые загрязнили образец, на основе установленных стробов. Имейте в виду, что при первом прохождении образца через машину может произойти некоторое отбеливание, что приведет к некоторому затемнению, что может привести к некоторому затемнению, может потребоваться внести некоторые корректировки.

После того, как образец будет отсортирован, приступайте к обработке ядер. Для этого берут 10 мил отсортированной пробы и добавляют два мила раствора сахарозы, 50 микролитров одного моляра хлорида кальция и 30 микролитров одного моляра ацетата магния. Если отсортированный образец составляет менее 10 милов, увеличьте громкость до 10 милов, добавив один XPBS, или соответствующим образом отрегулируйте дополнительные материалы.

Далее несколько раз переверните образец и поместите его на лед на 15 минут. Через 15 минут центриф пробы в роторе качающегося ковша 1, 786 RCF в течение 15 минут при четырех градусах. После центрифугирования осторожно отсасывайте надосадочную жидкость, не нарушая белую гранулу, находящуюся на дне пробирки.

Затем растворите гранулу в 200 микролитрах соответствующего раствора, необходимого для проведения предыдущих экспериментов. В данном случае мы растворяем гранулу и буфер для последующего эксперимента с чипом. Затем повторно подвесьте гранулу по трубе вверх и вниз.

На этом этапе вы можете переложить ядра в пробирку меньшего размера и поместить ее в морозильную камеру с температурой минус 80 градусов по Цельсию. Что ж, я только что показал вам, как выделить ядра нейронов из посмертной ткани мозга человека. С помощью этих ядер можно проводить ряд различных анализов, таких как иммунопреципитация хроматина.

При выполнении этой процедуры важно помнить о том, что образцы всегда должны лежать на льду, так как ядро не закреплено и может разлагаться при длительной температуре. Кроме того, важно обращаться с человеческими тканями в соответствии со стандартами безопасности второго уровня биобезопасности или выше. Вот и все.

Спасибо за просмотр и удачи в ваших экспериментах.