Поведенческие Пробирной для измерения Отзывчивость данио рерио на изменения в интенсивности света

В лаборатории Даулинга мы изучаем физиологию и развитие сетчатки у данио-рерио, чтобы определить, способны ли мутанты данио-рерио, которые не могут распознавать движение, воспринимать свет и не являются ли они слепыми. Для этого мы тестируем их зрительно-моторную реакцию (VMR). Мы собираем мальков данио-рерио примерно через четыре дня после оплодотворения.

Поместите их в 96-луночные планшеты, подготовьте подходящую установку для визуализации, синхронизируйте программное обеспечение для видеотрекинга с планшетом, а затем отслеживайте двигательную реакцию рыб после переходов от света к темноте или от темноты к свету, что мы называем VMR. Здравствуйте, я Фарида Имран из лаборатории Джона Доулинга и отделения молекулярной и клеточной биологии Гарвардского университета.

А я — Джейсон Рио из лаборатории Александра Шира, которая также находится на факультете молекулярной и клеточной биологии Гарвардского университета. Сегодня мы продемонстрируем вам зрительно-моторную реакцию рыбок данио-рерио на увеличение и уменьшение интенсивности света.

Итак, приступим. Для начала анализа зрительно-моторного ответа вырастите личинок зебрафиш дикого типа при цикле освещения «свет-темнота» при температуре 28 °C до достижения возраста не менее четырех дней после оплодотворения. Для достижения наилучших поведенческих результатов мы используем стандартный цикл освещения: 14 часов света, начиная с 9:00, и 10 часов темноты, начиная с 23:00.

Избегайте чрезмерной плотности посадки личинок. Обычно мы содержат не более 50 личинок в одной чашке Петри. Через пять дней после оплодотворения мы переносим zebrafish в 96-луночный планшет с объемом лунки 650 µL, чтобы обеспечить личинкам достаточное пространство для плавания.

С помощью пластической переносной пипетки аккуратно перенесите по одной личинке в каждую лунку. После переноса рыб в лунки заполните каждую из них достаточным количеством воды для рыб, чтобы поверхность воды была почти вровень с верхним краем лунок. Старайтесь не переливать и не недоливать воду, чтобы избежать проблем с оптикой записывающей камеры.

Также следите за тем, чтобы в лунки не попали пузырьки воздуха. Теперь рыбки готовы к мониторингу локомоторных реакций на свет и темноту. Перенесем планшет с данио-рерио к записывающему устройству.

Теперь приступим к обзору записывающей аппаратуры. Плашка на 96 лунок с рыбами будет помещена в записывающую камеру здесь, в этот белый лоток, и зафиксирована с помощью пружины или резинки. Камера расположена в задней части корпуса и сфокусирована на плашке с помощью зеркал, закрепленных в верхней части корпуса здесь.

Угол наклона этих зеркал можно отрегулировать, поворачивая винты, которые фиксируют зеркала. Записывающая камера освещается снизу инфракрасными светодиодами. Это позволяет камере фиксировать рыбу даже в темноте.

Личинки не воспринимают ИК-свет, поэтому постоянное ИК-освещение не влияет на эксперимент. Белые светодиоды также освещают камеру регистрации снизу. Они управляются отдельно от ИК-ламп для экспериментов, которые длятся более нескольких часов.

Камеру можно заполнить медленно текущей водой, чтобы поддерживать постоянную температуру на протяжении всего эксперимента. Вода подается из резервуара с помощью небольшого аквариумного насоса и нагревается до 28 градусов с помощью обычного погружного аквариумного нагревателя. Вода сливается через большое сливное отверстие и рециркулирует обратно в резервуар, чтобы минимизировать посторонние вибрации в помещении.

Весь блок регистрации установлен на массивном балансировочном столе. Когда аппарат регистрации готов, крышка от коробки используется для накрытия животных с целью их дальнейшей изоляции от света. Теперь перейдем к юстировке 96.

Поместите 96-луночный планшет с рыбами в камеру записи, совместив его с компьютерной сеткой программного обеспечения для видеотрекинга. При использовании водяной бани для длительных экспериментов медленно погружайте планшет в воду, чтобы уровень воды стабилизировался и она не пролилась на планшет. В программном обеспечении ViewPoint проверьте, чтобы все личинки и область проведения эксперимента были видны на экране компьютера.

С помощью элементов управления программного обеспечения совместите сетку программы видеотрекинга с лунками 96-луночного планшета таким образом, чтобы каждая рыбка находилась внутри одного квадрата сетки. Этот этап крайне важен для всех ваших записей. Компьютер для трекинга будет рассчитывать перемещение отдельно для каждого из этих квадратов.

Таким образом, при неправильном выравнивании компьютерной сетки некоторые перемещения рыб могут быть упущены или, что еще хуже, две соседние рыбы окажутся в одной области и после выравнивания будут засчитаны как одна рыба. Время включения и выключения света запрограммировано в компьютере.

Обычно мы выдерживаем личинок в боксе в условиях умеренной темнового адаптации в течение трех часов. Это позволяет не только получить базовый уровень активности, но и дает личинкам возможность успокоиться после дозирования пипеткой и манипуляций. Затем мы закрываем дверцу регистрационной камеры и начинаем запись.

На практике мы регистрируем активность каждой рыбки посекундно, однако программное обеспечение ViewPoint фактически записывает данные покадрово. Ниже на экране вы видите трассировку перемещений одной рыбки в режиме реального времени. Что касается перемещения пикселей, белая линия указывает на то, что количество изменений пикселей ниже заданного порога, а зеленая — что изменение пикселей превышает установленный порог.

Пороговое значение будет в некоторой степени зависеть от вашей конкретной камеры и настройки освещения. В нашей установке мы обычно используем порог в четыре пикселя. То есть, если изменяется менее четырех пикселей, это считается фоном.

Если в движении находится более четырех пикселей, это указывает на перемещение рыбы. Эмпирическим путем мы определили, что данный порог позволяет обнаружить почти все плавательные и поворотные движения личинок. Несмотря на то, что записывающие боксы достаточно хорошо изолируют личинок, мы все равно выключаем свет в помещении и стараемся свести к минимуму помехи в виде механического шума, такого как открывание и закрывание дверей в комнате, проведение танцевальных вечеринок или выполнение физических упражнений.

После завершения эксперимента перенесите собранные данные в таблицу Excel или в предпочитаемый вами пакет программ для анализа. Ниже представлен вид этих данных. Они содержат время в секундах с начала эксперимента и активность каждой личинки в секунду.

Здесь представлен график активности одной личинки на протяжении всего эксперимента, где стрелками отмечены несколько реакций включения и выключения. На данном графике показана средняя активность 40 рыб за весь период эксперимента с несколькими реакциями включения и выключения, отмеченными стрелками. Как видно, реакции включения и выключения выражены отчетливо и носят стабильный характер.

Этот эксперимент по изучению зрительно-моторного ответа можно также проводить на мутантных рыбах. Для таких исследований мы обычно размещаем рыб дикого типа и мутантных рыб на одной и той же планшете в шахматном порядке для обеспечения оптимального контроля. При использовании мутантных рыб на одном планшете с рыбами дикого типа обязательно запишите, какой тип рыб был помещен в каждую лунку.

Вот предложение о том, как отслеживать количество рыб, помещенных в каждую лунку. Здесь представлены результаты визуального моторного отклика, в которых сравниваются личинки дикого типа и мутантные личинки. Мы снова видим выраженные и стабильные реакции включения и выключения у личинок дикого типа.

Однако личинки мутанта chalk, у которых отсутствует развитие глаз, не проявляют значительного увеличения активности ни при увеличении, ни при уменьшении интенсивности света, а также имеют низкий базовый уровень активности. Эти результаты позволяют сравнить ответы дикого типа с мутантами NO OKR, также называемыми мутантами NRC. На основании теста OKR считалось, что мутант NRC полностью слеп.

С помощью теста VMR мы демонстрируем, что мутант NRC обладает нормальным ответом на выключение света, но замедленным и вялым ответом на его включение. Таким образом, мутант NRC не является полностью слепым, как считалось ранее. Мы только что продемонстрировали вам зрительно-моторную реакцию лабораторных зебраниновых данио на увеличение и уменьшение интенсивности света.

При выполнении данной процедуры важно помнить, что эксперимент следует проводить в дневное время, так как рыбы более активны и чувствительны к изменениям интенсивности света днем, чем ночью. На этом всё.

Благодарим за просмотр и желаем успехов в ваших экспериментах.