Метилированный Иммунопреципитация ДНК

В этом видео демонстрируется протокол иммунопреципитации метилированной ДНК или митапа. Метод, используемый для специфической изоляции метилированной ДНК несмещенным образом. Метилирование ДНК у млекопитающих характеризуется добавлением метильной группы к положению цитозина С-5.

При наличии в динуклеотиде CPG он является обратимой эпигенетической меткой, которая играет важную роль в нормальном развитии, а также в некоторых патологических процессах. Нормальные функции метилирования ДНК включают инактивацию Х-хромосомы у женщин, подавление повторяющихся элементов, геномный импринтинг и поддержание стабильности генома. Также было показано, что метилирование ДНК играет роль в развитии многочисленных заболеваний, таких как рак, синдром дер Вилли, синдром Энгельмана, а также иммунодефицит, центровая нестабильность и синдром лицевой аномалии.

При раке, например, аномальное гиперметилирование и промоторы могут привести к подавлению жизненно важных генов-супрессоров опухолей. В то время как неправильное гипометилирование приводит к хромосомной нестабильности и активации онкогенов, встреча достигается путем первого звукового катания ДНК на фрагменты размером от 300 до 1000 пар оснований. Затем обработанная ультразвуком ДНК денатурируется при температуре 95 градусов Цельсия.

Первичные антитела, которые распознают пять основных метазинов, добавляются и позволяют им связываться с метилированными фрагментами ДНК. Вторичные антитела, конъюгированные с магнитными шариками дины, используются для выделения фрагментов ДНК, которые были связаны первичным антителом. Неметилированные фрагменты удаляются, а антитела расщепляются протеиназой.

Очистка фенилхлороформа KA удаляет переваренный белок, а осаждение очищает ДНК, которая теперь обогащается метилированными фрагментами. Meetup, DNA может быть использована для таких приложений, как микрочип ПЦР и секвенирование. Встреча обычно проводится в течение двух дней.

Первый день включает в себя подготовку ДНК, ультразвуковую терапию, иммунопреципитацию и переваривание белка. Второй день включает экстракцию pH хлороформа и осаждение этанола для очистки и выделения ДНК, обогащенной для метилирования. Существует несколько специальных материалов, которые требуются для встречи, в том числе силиконизированные центрифужные трубки, устройство для солнцевания ДНК, первичное антитело, мышь с метазином, моноклональное антитело, вторичное антитело, гранулы дина, конъюгированные с овцами, анти-US IgG, а также магнитный штатив для трубок.

Первым шагом в протоколе митапа является подготовка ДНК. Крайне важно заранее оценить природу ДНК. Необходимо знать состояние образца ДНК, является ли он преимущественно двухцепочечным или одноцепочечным, поскольку точное количественное определение образца имеет первостепенное значение, а наличие нежелательных видов ДНК может отрицательно сказаться на различных методах определения количества ДНК.

Количество двухцепочечной ДНК можно легко оценить с помощью спектральной фотометрии с помощью NanoDrop 3, 300 nd загрузить 1,5 микролитра и установить тип измерения на нуклеиновую кислоту, выбрать DNA 50 в качестве расчета и инициализировать прибор 1,5 микролитрами воды. Очистите тумбы и заболочьте инструмент 1,5 микролитрами жидкости. Образец растворяют в чистых тумбах, загружают 1,5 микролитра образца и ударяют по меркам.

Концентрация будет дана и может быть использована. Чтобы рассчитать необходимое мне количество микролитров, здесь идеально подойдет соотношение A two 60 to two 80 1,8. Подготавливается проба в один микрограмм.

Тем не менее, для получения успешных результатов достаточно образца размером всего в 200 нанограммов. Для встречи загрузите образец ДНК в чистую силиконизированную пробирку. Добавьте достаточное количество стерильной воды, чтобы довести итоговый объем до 50 микролитров.

Ультразвуковая обработка ДНК и иммунопреципитация должны проводиться в силиконизированных пробирках, чтобы предотвратить неспецифическое связывание ДНК и белков со стенками трубок. После того, как ДНК была подготовлена, образец должен быть подвергнут ультразвуковой обработке для фрагментации ДНК, так как иммунопреципитация более эффективна с более мелкими фрагментами ДНК, загрузите образец в ультразвуковую систему, убедитесь, что настройка мощности установлена на высоком уровне, и что машина настроена на 30 секунд. На 30 секунд выкл заполните основание в линию заливки водой с четырьмя градусами Цельсия.

Обрабатывайте образец ультразвуком в течение семи минут. Когда ультразвуковая обработка будет закончена, извлеките трубку и положите ее на лед. Важно заранее оптимизировать условия ультразвуковой обработки для предполагаемого образца, размер ДНК.

Например, для частично деградировавшего образца ДНК потребуется более короткое время ультразвуковой обработки. Продукты ультразвуковой обработки могут быть визуализированы с помощью стандартных электрофоретических методов. Фрагменты ДНК размером от 300 до 1000 пар оснований желательны на этом этапе для последующего использования.

В анализах микрочипов и ПЦР вы должны зарезервировать одну пятую часть вашей ДНК в качестве входной или референсной ДНК, в этом случае 800 нанограммов ультразвуковой ДНК будут использоваться для иммунопреципитации, а оставшаяся часть будет выделена в качестве референсной ДНК. Следующим этапом в протоколе среды является реакция иммунопреципитации или ИП перед добавлением первичного антитела, ДНК должна быть денатурирована. Денатурация необходима, потому что первичное антитело чувствительно к одноцепочечной ДНК.

Поместите образец на водяную баню при температуре 95 градусов Цельсия на 10 минут. Когда этап денатурации будет завершен, немедленно перенесите трубку в лед не менее чем на пять минут. Это предотвратит денатурацию ДНК Рина на коленях и обеспечит оптимальное связывание антител, когда образец остынет.

Коротко покрутите трубку, чтобы вытянуть содержимое на дно. Далее следует добавить первичное антитело. Количество используемых антител следует титровать для каждой партии и для каждого производителя.

В этом случае мы добавляем пять микрограммов первичного антитела, а затем добавляем буфер иммунопреципитации или буфер IP до конечного объема 500 микролитров. Затем ДНК IP помещают во вращатель и оставляют инкубироваться при температуре четыре градуса Цельсия в течение двух часов. Вращение необходимо для предотвращения конгломерации антител внутри пробирки во время инкубации.

Примерно за 15 минут до завершения первичной инкубации антител очистите и подготовьте магнитные гранулы дина. Во-первых, тщательно подвешиваем бусины в флаконе путем вортексирования. Затем перелейте 30 микролитров шариков в чистую силиконизированную пробирку и поместите эту пробирку на магнитную решетку для нескольких реакций.

Перелейте 30 микролитров гранул за одну реакцию, плюс достаточно для одной дополнительной реакции, чтобы предотвратить ошибку пипетирования или непреднамеренную потерю некоторых гранул. Например, для восьми реакций. Удалите достаточное количество шариков на девять реакций или 270 микролитров.

Магнитные шарики будут притягиваться к стене магнитной стойки. Подождите две минуты, чтобы шарики мигрировали и образовали определенную полосу на стенке трубки. Далее снимите надосадочную жидкость и аккуратно выбросьте надосадочную жидкость, стараясь не потревожить шарики на задней стенке наконечником пипетки.

Замените надосадочную жидкость с избыточным объемом IP буфера вихревым и положите его обратно на магнитную стойку на две минуты. Повторите эту промывку еще раз и снова суспендируйте шарики в исходном объеме буфера IP. Извлеките пробирку с образцом из ротатора после завершения инкубации.

Чтобы завершить иммуноосаждение, добавьте в реакцию 30 микролитров чистых шариков и поместите пробирку обратно во вращатель на два часа при температуре четыре градуса Цельсия. Во время этой инкубации вторичное антитело, которое является антимышиным IgG, будет связываться с первичным мышиным антителом. Антитела против мышей конъюгированы с магнитными гранулами дина, что позволяет легко извлекать связанные продукты и выполнять последующий этап очистки.

После завершения инкубации с обоими антителами поместите IP-трубку на магнитную стойку на две минуты. На этом этапе метилированная ДНК будет связана с первичным антителом, которое, в свою очередь, будет связано с конъюгированным с шариками дины вторичным антителом. Извлеките и выбросьте надосадочную жидкость и замените ее 500 микролитрами буфера IP.

Перемешайте содержимое тюбика и поместите его обратно на решетку на две минуты. Повторите эту промывку с IP-буфером еще раз. После снятия надосадочной жидкости с последней промывки Ресус, подвесьте бусины в последний раз.

В 400 микролитрах буфера для пищеварения обработайте реакцию 100 микрограммами протеиназы К и инкубируйте в течение ночи при температуре 50 градусов Цельсия. Лечение протеиназой К необходимо для переваривания белков антител и любого остаточного белка, связанного с ДНК, что позволяет метилированной ДНК высвобождаться в раствор. Очищение ДНК проводят на второй день процедуры митапа, извлекают пробирку для дигеста из инкубатора.

В вытяжной шкаф добавьте 500 микролитров фенохлороформа один к одному при pH 7 в пробирку и тщательно закрутите пробирку в течение 10 минут при температуре 13 000. G. Осторожно удалите верхнюю водную фазу из трубки, не нарушая границу раздела и не удаляя органический слой. Перенесите водную фазу в новую трубку.

Повторное извлечение может быть выполнено, если интерфейс выглядит мутным. Далее добавляем один 10-й объем трех моляров ацетата натрия в данном случае 40 микролитров. Один микролитр гликогена может быть использован в качестве носителя для облегчения очистки гранул.

Сделайте вихревой пробиркой, чтобы перемешать содержимое. Затем добавьте два объема 100% этанола, вортекс и заморозьте в морозильной камере при температуре минус 20 градусов Цельсия на 20 минут после заморозки. Осажденную ДНК раскручивают в центрифуге при 13 000 G и четырех градусах Цельсия в течение 20 минут.

На дне пробирки образуется гранула ДНК. Извлеките пробирку из центрифуги и удалите этанол. Будьте осторожны, чтобы не потревожить гранулу на дне трубки.

Для удаления остатков этанола может потребоваться импульсный отжим. Чтобы промыть гранулы, добавьте 500 микролитров холодного, 70% этанола вихря, и снова крутите в течение 20 минут при температуре 13 000 G и четырех градусах Цельсия. Когда второй отжим будет завершен, снимите импульсный отжим с 70% этанолом и удалите остаточный этанол с помощью пипетки А.

Оставьте пробирку на решетке с открытой крышкой, чтобы высушить гранулы и дать оставшемуся этанолу испариться. Наконец, Ройс суспендирует гранулу, содержащую только ДНК, обогащенную для метилирования, и 10 микролитров стерильной воды, давая достаточно времени для растворения ДНК-гранулы перед использованием. Хорошей практикой является подтверждение квалификации митапа с помощью ПЦР.

Это можно сделать путем проведения ПЦР-реакций, предназначенных для амплификации продуктов, которые дифференциально иллюстрируют метилированные и неметилированные фрагменты ДНК для амплификации нормальных праймеров ДНК человека. Контрольная область импринтинга H 19 может быть использована в сочетании с праймерами, предназначенными для амплификации области генома, которая не метилирована. Например, последовательности праймеров и условия циклирования ПЦР можно найти в прилагаемом протоколе.

На этом этапе необходимо извлечь входную или референсную ДНК, которая была отложена в начале протокола встречи. Один набор ПЦР-реакций будет организован с использованием входной ДНК, а другой набор будет использовать IP-ДНК, обогащенную для метилирования. Если встреча прошла успешно, то в рамках ПЦР с использованием праймеров метилирования будет получен продукт, а не продукт с использованием контрольных праймеров.

И наоборот, входная ПЦР должна производить продукты с использованием обоих праймеров, поскольку она содержит как метилированные, так и неметилированные. Фрагменты ДНК. ДНК, обогащенная метилированными фрагментами, может быть использована для ряда последующих приложений, таких как секвенирование ПЦР и анализ микрочипов.

При интеграции с другими методами молекулярной биологии он может быть использован для исследования статуса метилирования ДНК локус-специфичным или полногеномным способом для профилирования метилирования или изучения эпигеномики.