Метилированный Иммунопреципитация ДНК

В данном видео демонстрируется протокол иммунопреципитации метилированной ДНК или метод MeDIP. Этот метод используется для специфического выделения метилированной ДНК беспристрастным образом. Метилирование ДНК у млекопитающих характеризуется присоединением метильной группы к пятому положению цитозина.

В составе CpG-динуклеотида метилирование представляет собой обратимую эпигенетическую метку, которая играет важную роль в нормальном развитии, а также при ряде патологических процессов. К нормальным функциям метилирования ДНК относятся инактивация X-хромосомы у женщин, сайленсинг повторяющихся элементов, геномный импринтинг и поддержание стабильности генома. Также было показано, что метилирование ДНК играет роль при многочисленных заболеваниях, таких как рак, синдром де Лари (синдром Вильямса), синдром Энгельмана, иммунодефицит, а также синдром центромерной нестабильности и аномалий лица.

При онкологических заболеваниях, например, аномальное гиперметилирование промоторов может привести к сайленсингу жизненно важных генов-супрессоров опухолей. В то время как неправильное гипометилирование приводит к хромосомной нестабильности и активации онкогенов, подготовка образца осуществляется путем предварительного ультразвукового расщепления ДНК на фрагменты размером от 300 до 1000 пар оснований. Затем соникатированная ДНК денатурируют при 95 °C.

Добавляют первичные антитела, распознающие 5-метилцитозин, и дают им связаться с метилированными фрагментами ДНК. Для выделения фрагментов ДНК, связавшихся с первичными антителами, используют вторичные антитела, конъюгированные с магнитными дина-сферами. Неметилированные фрагменты удаляют, а антитела переваривают протеиназой.

Очистка смесью фенола и хлороформа удаляет переваренный белок, а осаждение очищает ДНК, которая теперь обогащена метилированными фрагментами. Полученная ДНК может быть использована в таких приложениях, как ПЦР-микрочипы и секвенирование. Данная процедура обычно выполняется в течение двух дней.

Первый день включает подготовку ДНК, соникацию, иммунопреципитацию и переваривание белков. Второй день включает экстракцию хлороформом при определенном pH и осаждение этанолом для очистки и выделения ДНК, обогащенной метилированными фрагментами. Для работы требуются некоторые специальные материалы, в том числе силиконизированные центрифужные пробирки, устройство для соникации ДНК, первичные антитела (моноклональные мышиные антитела к 5'-метилцитозину), вторичные антитела (Dynabeads, конъюгированные с овечьими анти- IgG человека) и магнитный штатив для пробирок.

Первым этапом протокола The meetup является подготовка ДНК. Крайне важно заранее оценить природу ДНК. Необходимо знать состояние ДНК образца — является ли она преимущественно двухцепочечной или одноцепочечной, так как точное количественное определение образца имеет первостепенное значение, и на различные методы определения количества ДНК может негативно влиять присутствие нежелательных форм ДНК.

Количество двухцепочечной ДНК можно легко определить с помощью спектрофотометрии на приборе NanoDrop 3000: нанесите 1,5 µL образца, установите тип измерения «нуклеиновая кислота» (nucleic acid), выберите в качестве метода расчета «DNA 50» и инициализируйте прибор, используя 1,5 µL воды. Очистите пьедесталы и проведите обнуление прибора (blank), нанеся 1,5 µL жидкости. Образец растворен в этой же жидкости; очистите пьедесталы, нанесите 1,5 µL образца и нажмите кнопку измерения (measure).

Концентрация будет указана и может быть использована. Для расчета необходимого количества микролитров рекомендуется использовать соотношение A260 к A280, при этом идеальным значением здесь является 1,8. Готовится образец с содержанием 1 мкг.

Тем не менее, для получения успешных результатов достаточно образца массой всего 200 нанограммов. Для этого внесите образец ДНК в чистую силиконизированную пробирку. Добавьте достаточное количество стерильной воды, чтобы довести конечный объем до 50 микронлитров.

Соникацию и иммунопреципитацию ДНК необходимо проводить в силиконизированных пробирках, чтобы предотвратить неспецифическое связывание ДНК и белков со стенками пробирок. После подготовки ДНК образец необходимо подвергнуть соникации; фрагментация ДНК требуется для повышения эффективности иммунопреципитации, которая проходит успешнее с более короткими фрагментами ДНК. Поместите образец в соникатор, убедитесь, что установлена высокая мощность и время обработки составляет 30 секунд. После завершения 30-секундного цикла заполните основание до метки водой при температуре 4 °C.

Проведите соникацию образца в течение семи минут. По окончании соникации извлеките пробирку и поместите ее на лед. Важно заранее оптимизировать условия соникации в соответствии с ожидаемыми характеристиками вашего образца и размером ДНК.

Например, частично деградировавший образец ДНК потребует меньшего времени соникации. Продукты соникации можно визуализировать с помощью стандартных методов электрофореза. На данном этапе для последующего использования требуются фрагменты ДНК длиной от 300 до 1000 пар оснований.

При проведении микрочипового анализа и ПЦР следует зарезервировать одну пятую часть вашей ДНК для использования в качестве исходной или референсной ДНК; в данном случае 800 нанограмм соникарованной ДНК будет использовано для иммунопреципитации, а остальная часть будет отложена в качестве референсной ДНК. Следующим этапом протокола является иммунопреципитация или реакция IP; перед добавлением первичных антител ДНК должна быть денатурирована. Денатурация необходима, так как первичные антитела чувствительны к одноцепочечной ДНК.

Поместите образец в водяную баню при 95 °C на 10 минут. По завершении этапа денатурации немедленно перенесите пробирку на лед минимум на пять минут. Это предотвратит ренатурацию денатурированной ДНК и обеспечит оптимальное связывание антител после охлаждения образца.

Кратковременно центрифугируйте пробирку, чтобы осадить содержимое на дно. Затем следует добавить первичные антитела. Количество используемых антител необходимо титровать для каждой партии и для каждого производителя.

В данном случае мы добавляем 5 µg первичных антител, затем добавляем буфер для иммунопреципитации (IP-буфер) до конечного объема 500 µL. Далее смесь с ДНК для IP помещают в ротатор и инкубируют при температуре 4 °C в течение двух часов. Ротация необходима для предотвращения агрегации антител в пробирке в процессе инкубации.

Примерно за 15 минут до завершения инкубации с первичными антителами очистите и подготовьте магнитные сферы DynaBeads. Сначала тщательно ресуспендируйте сферы во флаконе с помощью вортекса. Затем перенесите 30 µL сфер в чистую силиконизированную пробирку и поместите ее на магнитный штатив для нескольких реакций.

Перенесите 30 мкл гранул на одну реакцию, добавив объем для одной дополнительной реакции, чтобы компенсировать погрешность пипетирования или случайную потерю гранул. Например, для восьми реакций отберите количество гранул для девяти реакций, то есть 270 мкл.

Магнитные бусины будут притягиваться к стенке магнитного штатива. Подождите две минуты, чтобы бусины переместились и осели в виде четкой полосы на стенке пробирки. Затем аккуратно удалите и отбросьте супернатант с помощью пипетки, стараясь не задеть бусины на задней стенке наконечником пипетки.

Замените супернатант избыточным объемом буфера для иммунопреципитации (IP-буфера), перемешайте на вортексе и снова поместите на магнитный штатив на две минуты. Повторите эту процедуру промывки еще раз, затем ресуспендируйте осажденные бусины в исходном объеме IP-буфера. Извлеките пробирку с образцом из ротатора по завершении инкубации.

Для завершения иммунопреципитации добавьте 30 µL чистых магнитных частиц в реакционную смесь и поместите пробирку обратно в ротатор на два часа при температуре 4 °C. В ходе этой инкубации вторичные антитела (анти-мышиные IgG) свяжутся с первичными мышиными антителами. Анти-мышиные антитела конъюгированы с магнитными частицами DynaBeads, что позволяет легко извлекать связанные продукты и проводить последующий этап очистки.

После завершения инкубации с обоими антителами поместите пробирку для иммунопреципитации (IP) на магнитный штатив на две минуты. К этому моменту метилированная ДНК будет связана с первичным антителом, которое, в свою очередь, будет связано с вторичным антителом, конъюгированным с магнитными частицами DynaBeads. Удалите и утилизируйте супернатант, заменив его 500 µL буфера для IP.

Перемешайте содержимое пробирки и верните ее на штатив на две минуты. Повторите данную промывку буфером для иммунопреципитации (IP-буфером) еще один раз. После удаления супернатанта после последней промывки в очередной раз суспендируйте гранулы.

В 400 µL буфера для переваривания обработайте реакционную смесь 100 µg протеиназы K и инкубируйте в течение ночи при 50 °C. Обработка протеиназой K необходима для переваривания белков антител и любых остаточных белков, связанных с ДНК, что позволяет метилированной ДНК перейти в раствор. Очистка ДНК проводится на второй день процедуры; извлеките пробирку с гидролизатом из инкубатора.

В вытяжном шкафу добавьте в пробирку 500 µL фенол-хлороформного раствора в соотношении 1:1 при pH 7 и тщательно перемешайте на вортексе. Центрифугируйте пробирку в течение 10 минут при 13 000 ×g. Осторожно удалите верхнюю водную фазу из пробирки, не затрагивая интерфейс и не удаляя органический слой. Перенесите водную фазу в новую пробирку.

Если межфазная граница выглядит мутной, можно провести вторую экстракцию. Затем добавьте 1/10 объема 3 М ацетата натрия, в данном случае 40 µL. Для облегчения очистки осадка в качестве носителя можно использовать 1 µL гликогена.

Перемешайте содержимое пробирки на вортексе. Затем добавьте два объема 100% ethanol, перемешайте на вортексе и поместите в морозильную камеру при температуре -20 °C на 20 минут. После замораживания осажденную ДНК центрифугируют при 13 000 G и 4 °C в течение 20 минут.

На дне пробирки образуется осадок ДНК. Извлеките пробирку из центрифуги и удалите этанол. Будьте осторожны, чтобы не повредить осадок на дне пробирки.

Для удаления остатков этанола может потребоваться короткое центрифугирование. Чтобы промыть осадок, добавьте 500 µL холодного 70% этанола, перемешайте на вортексе и снова центрифугируйте в течение 20 минут при 13 000 G и четырех °C. После завершения второго этапа центрифугирования удалите 70% этанол коротким центрифугированием и уберите остатки этанола с помощью пипетки.

Оставьте пробирку в штативе с открытой крышкой, чтобы осадок высох, а остатки этанола испарились. В завершение ресуспендируйте осадок, содержащий только обогащенную метилированием ДНК, в 10 µL стерильной воды, выждав достаточное время для полного растворения осадка ДНК перед использованием. Рекомендуется подтвердить эффективность выделения с помощью ПЦР.

Это можно осуществить путем проведения ПЦР-реакций, предназначенных для амплификации продуктов, которые дифференцированно отображают метилированные и неметилированные фрагменты ДНК с использованием праймеров для амплификации нормальной ДНК человека. Контрольный регион импринтинга H 19 может использоваться совместно с праймерами, предназначенными для амплификации неметилированного участка генома. Примеры последовательностей праймеров и условий циклов ПЦР приведены в прилагаемом протоколе.

На этом этапе необходимо использовать исходную или контрольную ДНК, которая была отложена в начале протокола «встречи» (meetup). Один набор ПЦР-реакций будет поставлен с использованием исходной ДНК, а другой — с использованием ИП-ДНК, обогащенной по метилированию. Если «встреча» прошла успешно, ПЦР-анализ ИП-ДНК даст продукт при использовании праймеров на метилирование и не даст продукта при использовании контрольных праймеров.

Напротив, при проведении контрольной ПЦР должны появиться продукты с использованием обоих праймеров, так как образец содержит как метилированные, так и неметилированные фрагменты ДНК. ДНК, обогащенная метилированными фрагментами, может быть использована для ряда последующих приложений, таких как секвенирование продуктов ПЦР и микрочиповый анализ.

При интеграции с другими методами молекулярной биологии этот подход может быть использован для исследования статуса метилирования ДНК с локус-специфическим или общегеномным охватом для профилирования метилирования или изучения эпигеномики.