Селективный маркировки на поверхности клеток белков, используя CyDye ПГЛП Fluor Минимальная Красители

Меня зовут Мария, и я работаю в Y Healthcare в NOS в Швеции. Белки клеточной поверхности часто участвуют в коммуникации между клетками и окружающей средой и поэтому представляют особый интерес для исследований, направленных на получение более глубокого понимания заболеваний, а также других биологических вариаций, вызванных изменениями в клеточной среде. В этом видео я покажу вам простой протокол маркировки клеточной поверхности, и вы сможете визуально обогатить эти белки с низким содержанием золота без физического усиления, а также изучить различия между этими белками клеточной поверхности с помощью этой технологии.

Если вас заинтересовала эта технология, вы можете найти больше информации в справочнике по 2D. Кроме того, у нас есть указание по применению по этой конкретной теме, которое вы можете скачать из job В протоколе маркировки поверхности клеток, показанном сверху, вы помечаете клетки, пока они еще не повреждены. В процессе мечения краситель будет иметь доступ только к белкам клеточной поверхности.

После этапа мечения клетки анализируются для проверки маркировки, специфичной для поверхности клетки. Образец метки фракционировали на мембранные и цитозольные белки. Параллельно готовили нефракционированный образец.

Для сравнения, этот анализ фракционирования не является необходимым, но был проведен здесь только для того, чтобы показать, что протокол клеточной поверхности специфичен для профессиональных советов по клеточной поверхности. Мы также выполнили стандартный протокол маркировки ETH без диеты, показанный ниже: клетки ложатся до мечения, и таким образом все клеточные белки доступны для мечения. После этапа маркировки образцы подвергаются 2D-электрофорезу.

Адгезивные клетки отделяются с помощью неферментативной процедуры, чтобы избежать переваривания целевых белков клеточной поверхности. В этом протоколе мы используем резинового полицейского, но использование ферментной среды для диссоциации трех клеток также является возможностью подсчета и разделения клеточных суспензий на ква от 5 до 10 миллионов клеток в пробирке. Затем клетки гранулируют и промывают в H-P-S-S-P-H 7.4 для удаления следов клеточной культуры.

Загрязнение среды сывороточными белками и флуоресцентными компонентами может препятствовать мечению и обнаружению. Клетки, растущие в суспензии, непосредственно гранулируются и промываются перед этапом мечения после промывки. Клеточная палитра ресуспендирована в 200 микролитрах ледяного буфера для мечения, содержащего HPSS pH 8,5 и одну молярную мочу.

Для оптимальных условий мечения белков клеточной поверхности всегда проверяйте pH. Перед маркировкой мы использовали 600 PIC Mold side-Eye для 10 миллионов клеток CHO. Оптимальное соотношение бокового глаза к количеству клеток будет варьироваться в зависимости от типа клетки.

Так как мы не знаем точных концентраций белка на поверхности клетки. Как определить оптимальные условия для мечения белков боковым глазом, описано в справочнике «Принципы и методы 2D-электрофореза». Клетки инкубируются с боковым глазом D floor, минимальным количеством кубиков в течение 20 минут на льду в темноте.

После реакции мечения нереактивный краситель гасят добавлением 20 микролитров 10 миллимолярного лизина. Теперь ячейки метки дважды промываются в холодном буфере HPSS pH 7,4 для удаления лишнего бокового глаза. Таким образом, не останется свободного красителя для нежелательного внутриклеточного мечения или белков на следующем этапе, которым является лизис клеток.

Белки на поверхности клетки теперь помечены, а клетки промыты и готовы к лицензиату. Гранулы из потерянной стадии промывки ресуспендируют в 150 микролитры буфера холодного лизиса, содержащего семь моляров мочевины, два моляра и уриа, 4% чапов 30 миллимолярных деревьев пять миллимоляров ацетата магния pH 8,5 и оставляют на льду не менее чем на один час с периодическим облеганием вихря. Теперь образцы готовы к 2D-разделению.

Первым шагом в электролизе является подготовка IPD-полосок для регидратации. Приготовьте раствор для районной регидратации, добавив буфер IPG, соответствующий интервалу pH используемых полосок, и добавьте раствор в линзу лотка для регидратации. Снимите защитную пленку с полоски IPG и осторожно поместите полоски высушенным гелем вниз в лоток для регидратации, содержащий раствор для регидратации.

Закройте крышку коробки IPG и увлажните полоски на ночь. В первом измерении, изоэлектрической фокусировке, белки разделены в соответствии с их pi. Это выполняется с помощью IPG четыре три.

Регидратированные полоски помещаются в коллектор, а сверху монтируется электрод. 50 мкг из каждого образца наносятся с помощью колпачков для нанесения образца. Мы либо непосредственно применяли нефракционированные образцы без предварительного фракционирования, либо фракционировали образцы на мембранные и цитозольные фракции до их нанесения.

Провод закрыт для защиты флуоресцентных образцов от света. Прибор был запрограммирован в соответствии с рекомендациями и работал в течение ночи. Большие 12%-ные 12%-ные гели стоили при использовании взрослого 12 геля.

Для предотвращения попадания полимеризованных гелей в трубки был добавлен раствор для вытеснения костеров. Перед использованием гелям дали полимеризоваться в течение ночи при комнатной температуре. После изоэлектрической фокусировки полоски удаляют и уравновешивают в буфере, содержащем SDS, в два этапа с использованием DTT для уменьшения дисульфидных связей остатков цистеина с последующим алкилированием ацетамидом, чтобы избежать модификации акриламидом.

Полоски IPG погружаются в проточный буфер и аккуратно помещаются поверх двух больших гелей для копания. Избегайте попадания воздуха между полосками и герметизированным гелем, добавив сверху расплавленный 2%-ный раствор агро с бромоаноловым синим. Теперь гели готовы к разделению страниц SDS второго измерения На странице SDS второго измерения.

Белки будут разделены в соответствии с молекулярной массой, и это выполняется с помощью тональной шестиугольной системы. Заполните камеру электрофореза анодным рабочим буфером, вставьте гели и заполните верхний отсек программой катодного рабочего буфера. Блок питания в соответствии с рекомендациями и работой второго измерения защищен от света примерно на четыре-пять часов или до тех пор, пока фронт красителя не достигнет дна геля.

После электрофореза второго измерения гелевые кассеты размещаются с помощью захватов флуоресцентного тепловизора Typhoon. Одновременно можно сканировать два геля и три канала. Результат этого двойного DL показывает высокое разрешение мембранных белков в образце, даже если существуют некоторые известные ограничения для обнаружения гидрофобных белков в A 2 DL. Результаты показывают много новых пятен на клеточной поверхности, показанных здесь красным цветом, которые не обнаруживаются с помощью стандартного протокола мечения, показанного здесь зеленым цветом.

Эти результаты показывают, что протокол мечения клеточной поверхности очень специфичен для мечения белков клеточной поверхности. Поскольку белки клеточной поверхности имеют исключительную метку, их легче визуализировать, что позволяет избежать ослабления избытком цитозольных белков. Сверху показано флуоресцентное изображение гелей с нефракционированной мембранной фракцией или цитозольной фракцией.

Ниже приведено изображение того же гелевого столба с серебром. Результаты не показывают флуоресцентного мечения цитозольных белков, но окрашивание серебром показывает, что в гелях есть белки. Результаты также показывают схожие паттерны карты пятен от нефракционированных и мембранных фракций, демонстрируя, что нет необходимости в фракционировании перед 2D-электрофорезом, что делает этот протокол простым и удобным.

СИ 2, СИ 3 и ТСМ 5 демонстрируют сходные схемы мечения и все они совместимы с протоколом обработки поверхности клеток. Эксперимент по диете был проведен с использованием всех трех боковых глазных DI floor minimal dy для изучения дифференциальной экспрессии белков клеточной поверхности в клетках СНО сывороточного голодания в течение разного периода времени. CY два образца клеточной поверхности из всех образцов в эксперименте были объединены и использованы в качестве внутреннего стандарта.

Дифференциальные изменения нескольких белков клеточной поверхности могут быть прослежены в период голодания. Более 18 новых мембранных белков были обнаружены с использованием протокола клеточной поверхности, которые не были обнаружены с помощью стандартного протокола для определения идентичности белков в препаративном геле. Необходимо было провести спайк с образцом поверхности клетки, чтобы облегчить сопоставление с пятнами на аналитическом наборе данных.

Вот и результаты. Результаты показывают высокое разрешение большого количества белков клеточной поверхности. Этот протокол очень специфичен для белков клеточной поверхности, и мечения внутриклеточных белков не наблюдалось.

С помощью этого метода вы можете обнаружить больше белка клеточной поверхности по сравнению со стандартным протоколом, и, как вы уже видели, это очень простой протокол для выполнения. Вы просто помечаете белки клеточной поверхности, пока они еще не повреждены, и запускаете их непосредственно на 2D-электрофорезе без фракционирования мембраны. Так что это очень хороший протокол для изучения белков клеточной поверхности и различий между белками с технологией D.