Поддерживаемые Planar Бислои для формирования Исследование иммунологических синапсов и Kinapse

Здравствуйте, меня зовут Майк Дастин из Института Герала и Медицинской школы Нью-Йоркского университета. Сегодня я проведу вас через процедуру формирования поддерживающей планарной биолай для исследования иммунологического синапса. Итак, приступим.

Чтобы сделать липидный бислой, мы готовим раствор из 20% никеля, хелатирующего липида, и 80% фосфатидилхолина в соответствующих количествах в стеклянной пробирке с одним-двумя миллилитрами хлороформа метанола. Первым шагом является выпаривание растворителя под струей газообразного азота в теплой водяной бане с температурой от 30 до 37 градусов Цельсия. Обычно это занимает около 15 минут.

Затем удалите остатки растворителя под высоким вакуумом с помощью лиофилизатора в течение 90 минут. Затем растворите липиды в 2%N восьмеричном глюкозциде-детергентном буфере до конечной концентрации 0,4 миллимоля. При этом создается раствор смешанного детергента фосфолипидных миклеток с образованием липосом.

Вы диализуете этот раствор против трех изменений трисового раствора для удаления моющего средства и образования липосом. Обычно мы работаем с объемами порядка одного миллилитра с трубкой диаметром шесть миллиметров с отсечкой около 10 килодальтон и тщательно исключаем наличие пузырьков воздуха при зажиме трубки. Мы стерильно фильтруем этот раствор и проводим диализ в чистых условиях и обрабатываем его в перчатках, стерилизованных на 70% этаноле.

Этот раствор должен быть кристально чистым и храниться под аргоннским газом для предотвращения окисления. Если решение мутное, значит, у вас образовались многостенные везикулы и вам нужно начать все сначала. Для того чтобы провести эксперимент, нам необходимо сначала определить, сколько ICAM one и MHC осаждены на заданной площади поверхности хелатирующего бислоя никеля при заданной концентрации растворимого белка.

Для этого мы наносим бислои на скорости стекла диаметром пять микрометров. Инкубируйте стеклянные шарики с белковыми растворами в условиях, приближенных к тем, которые находятся в проточных ячейках, используемых для визуализации, а затем считайте плотность связанного белка с помощью проточного иммунофлуорометрического анализа. Меченые FSI антитела с известным количеством флуоресцеина на молекулу используются для обнаружения поверхностно связанных белков, а стандартные гранулы флуоресцеина используются для калибровки проточного микрофлуориметра.

Мы установим условия, приближенные к условиям для антигенпрезентирующих клеток с 200 молекулами на квадратный микрометр ICAM One и от 0,2 до 20 молекул на квадрат. В микрометре I-E-K-M-C-C 91 1 0 3, сложные планарные бислои образуются спонтанно, когда липосомы сливаются со стеклом, но только в том случае, если его правильно очистить до чистого стекла. Мы используем кислотный раствор пианы, свежеприготовленную смесь серной кислоты и 30% перекиси водорода, которая разрушает весь органический материал, а также оставляет поверхность стекла очень гидрофильной.

При работе с пираньями мы носим полную защитную одежду, включая кислотный фартук и тяжелые кислотостойкие перчатки. Отходы необходимо тщательно отделять от органических отходов и правильно утилизировать. Чтобы приготовить кислотный раствор пираньи, добавьте в сухую стакан 75 миллилитров концентрированной серной кислоты и затем осторожно добавьте 25 миллилитров 30%-ной перекиси водорода.

Раствор быстро нагревается до более чем 100 градусов Цельсия, затем погрузите в раствор сухие покровные стекла на 15 минут. После этой инкубации в пираньях окуните крышки в очищенную воду, а затем промойте их в течение минуты с каждой стороны. Затем просушите крышку стекла с помощью вакуумного источника, чтобы слить очищенную воду.

Дайте раствору пираньи остыть и добавьте в контейнер для отходов пираньи, который оставляют с неплотно закрытой крышкой, хорошо заметной в вытяжном шкафу для образования бислоев. В нашей лаборатории используются двухкамерные двухкамерные системы би СФС, которые обладают преимуществами встроенного отопления. Система FCS two имеет основание из нержавеющей стали, которое зажимает микрофлюидный коллектор с верхней прокладкой 0,5 мм, микроводопровод, покрытый оксидом индия и олова для нагрева на одной поверхности и с жидкостной канавкой на другой стороне.

Беспыльная 0,25-миллиметровая прокладка, определяющая высоту проточной камеры, и очищенная от пираньи 40-миллиметровая круглая крышка, на которой формируется бислой для сборки проточной ячейки и формирования плоских бислоев. Поместите коллектор трубками, направленными вверх, на ровную поверхность. Затем поместите 0,5-миллиметровую прокладку с отверстиями, расположенными над трубками для жидкости, и убедитесь, что она сидит ровно.

Аккуратно поместите предметное стекло микроводопровода жидкостными каналами вверх и убедитесь, что оно сидит ровно, не оказывая давления вниз, пока не убедитесь, что отверстия в предметном стекле совпадают с микрожидкостными трубками. Затем проложите непыльную прокладку 0,25 миллиметра с прямоугольным вырезом на верхнюю часть предметного стекла микроводопровода так, чтобы канал был выровнен с жидкостными каналами и не было крупных воздушных пространств, поместите целых пять капель липосомной суспензии по одному микролитру на поверхность предметного стекла микроводопровода таким образом, чтобы расстояние от центра до центра между каждой каплей составляло 2,5 миллиметра. Пять липосомных капель могут иметь разный состав, но в этом случае мы сформируем только два бислоя, один из которых не содержит хелатирующих липидов никеля, а другой — содержит 10% хелатирующих липидов никеля.

Как только эти капли окажутся на месте, аккуратно поместите чехол на поверхность одним движением, как можно быстрее зажмите основание. Капли липосомы должны соприкасаться с покровным стеклом. Этот контакт не должен быть нарушен, так как бислои, вероятно, уже сформировались, и любые нарушения могут привести к дефектным бислоям.

На этом этапе важно не забыть отметить положение бислоев несколькими маленькими чернильными пятнами на предметном стекле, чтобы облегчить позиционирование покровного стекла на микроскопе. Подождите 20 минут, чтобы убедиться, что система уравновешена, переведите все растворы с помощью 20-миллилитрового шприца, подключенного к гибкой трубке длиной около 20 сантиметров, и трехстороннему стопорному крану. Затем еще одно отверстие запорного крана соединяется с проточной ячейкой с помощью короткой трубки для минимизации мертвой зоны между запорным краном и проточной ячейкой.

Наполните шприц буферным физиологическим раствором, содержащим хлорид магния, хлорид кальция, глюкозу и сывороточный альбумин человека. Подготовьте трубку и запорный кран, чтобы не было пузырьков воздуха. Затем подключите его к проточным ячейкам и протолкните пять миллилитров одним движением, следя за тем, чтобы пузырьки воздуха не проходили через бислой.

Теперь у вас будут бислои, чтобы ввести в бислой белки, помеченные шипением. Сначала его нужно заблокировать казеном и зарядить никелем. Наполните одномиллилитровый шприц раствором ионов никеля и подключите его к боковому порту, не задерживая пузырьки воздуха.

После введения раствора подождите 20 минут, чтобы обеспечить полную блокировку. Затем смойте блокирующий раствор с помощью H-B-S-H-S-A из 20-миллилитрового шприца. Теперь введите 0,5 миллилитра раствора H-B-S-H-S-A, содержащего полигис, меченный ICAM one и IEK.

В этом эксперименте ICAM помечен SCI пятью. Таким образом, за взаимодействием LFA one ICAM one можно следить, визуализируя перегруппировку ICAM one в бислое, в течение 30 минут белок связывается с бислоем, заряженным никелем, в то время как белок прилипает к бислою. Закрепите проточную ячейку на инвертированном микроскопе с помощью специальной предметной вставки.

Затем подключите нагревательную электронику, чтобы система могла уравновеситься при температуре 37 градусов Цельсия. С помощью сделанных ранее меток расположите проточную ячейку так, чтобы объектив был выровнен по одному из бислоев, и используйте интерференционно-отражательную микроскопию для определения местоположения фокальной плоскости, фокусируясь на изображении отраженного света полевой диафрагмы. Наконец, промойте несвязанный ICAM one из проточных ячеек.

Получение флуоресцентных изображений бислоя в одном канале ICAM в режимах Turf M и widefield. Это необходимо для подтверждения связывания ICAM one на бислое с никелевым покрытием относительно бислоя без никеля. Теперь проточная ячейка готова к приему ячеек.

Для этой демонстрации мы будем использовать трансгенные Т-клетки ND Т-клеточного рецептора, которые были трансдуцированы ретровирусным ENC-покрытием GFPs P zap 70, промыть клетки один раз H-B-S-H-S-A, а затем инкубировать клетки с меченным Alexa 5 68 FAB к Т-клеточному рецептору, чтобы мы могли отслеживать микрокластеры TCR. Через 15 минут разведите ячейки один к 10. Это разбавляет антитело H 57 настолько, что оно не мешает визуализации Turf M, но поддерживает насыщение рецептора Т-клеток, когда первоначально связанная фабрика начинает диссоциировать, а затем вводит их в проточную клетку.

Мы визуализируем иммунологический синапс в трехцветном режиме M цвета. Это включает в себя формирование взаимодействия LFA, ICAM one, формирование кластеров TCR и C smac, а также устойчивое формирование микрокластеров TCR, которые рекрутируют GFP ZAP 70. Некоторые из этих результатов очевидны во время сбора, в то время как для полной оценки других потребуется анализ постобработки.

Итак, мы только что показали вам, как использовать поддерживаемые планарные бислои для изучения иммунологического синапса. Очень важно, чтобы эти эксперименты работали, чтобы Т-клетки находились в очень хорошей форме, а буферизованный физиологический раствор PPS не очень подходит для долгосрочного культивирования Т-клеток. Итак, вы хотите извлечь клетки из культуры, поместить их в эту среду, а затем использовать их очень быстро.

Если вы обнаружите, что хотите провести долгосрочные эксперименты, есть несколько очень хороших бессывороточных сред, которые вы можете заменить буферизованным физиологическим раствором. Это позволит сохранить клетки живыми гораздо дольше, если вы хотите провести более длительные конечные точки, такие как производство цитокинов или пролиферация Т-клеток. Вот и все.

Спасибо за просмотр и удачи в ваших экспериментах.