Поддерживаемые Planar Бислои для формирования Исследование иммунологических синапсов и Kinapse

Здравствуйте, я Майк Дастин из Института Геральта и Медицинской школы Нью-Йоркского университета. Сегодня я ознакомлю вас с процедурой формирования поддерживающего планарного бислоя для изучения иммунологического синапса. Итак, приступим.

Для создания липидного бислоя мы готовим смесь из 20% никель-хелатирующего липида и 80% фосфатидилхолина в соответствующих количествах в стеклянной пробирке с одним-двумя миллилитрами смеси хлороформ-метанол. Первым шагом является испарение растворителя под током азота в теплой водяной бане при температуре от 30 до 37 °C. Обычно этот процесс занимает около 15 минут.

Затем удалите остатки растворителя в высоком вакууме с помощью лиофилизатора в течение 90 минут. После этого растворите липиды в физиологическом буферном растворе с добавлением 2% N октаглюкозида до конечной концентрации 0,4 мМ. В результате образуется раствор смешанных мицелл из детергента и фосфолипидов для последующего формирования липосом.

Этим раствором проводят диализ против трех смен Трис-солевого буфера для удаления детергента и формирования липосом. Обычно мы работаем с объемами порядка одного миллилитра, используя трубки диаметром шесть миллиметров с порогом отсечения около 10 киладальтон, при этом тщательно удаляя пузырьки воздуха при зажиме трубки. Мы подвергаем этот раствор стерилизующей фильтрации, проводим диализ в чистых условиях и работаем с ним в перчатках, стерилизованных 70% этанолом.

Данный раствор должен быть кристально прозрачным; его хранят в среде газа аргона для предотвращения окисления. Если раствор становится мутным, это означает, что образовались многослойные везикулы, и процедуру необходимо начать заново. Для подготовки эксперимента нам сначала нужно определить количество ICAM-1 и MHC, осаждаемых на определенную площадь поверхности никель-хелатного бислоя при заданной концентрации растворимого белка.

Для этого мы наносим бислои на стеклянные микросферы диаметром 5 мкм. Стеклянные микросферы инкубируют с растворами белков в условиях, приближенных к условиям в проточных кюветах, используемых для визуализации, после чего плотность связанного белка определяют с помощью проточного иммунофлуориметрического анализа. Для обнаружения белков, связанных с поверхностью, используют антитела, меченные FSI с известным количеством флуоресцеина на молекулу, а для калибровки проточного микрофлуориметра используют стандартные флуоресцентные микросферы.

Мы создадим условия, приближенные к тем, что наблюдаются на антигенпрезентирующих клетках, с плотностью 200 молекул ICAM-1 на квадратный микрометр и от 0,2 до 20 молекул IEKMC 91103 на квадратный микрометр. Плоские бислои формируются спонтанно при слиянии липосом со стеклом, но только в том случае, если стекло надлежащим образом очищено. Мы используем раствор Пирана, свежеприготовленную смесь серной кислоты и 30% перекиси водорода, который разрушает все органические вещества и делает поверхность стекла очень гидрофильной.

При работе с раствором «пиранья» мы используем полный комплект защитной одежды, включая кислотостойкий фартук и плотные кислотостойкие краги. Отходы необходимо тщательно отделять от органических отходов и утилизировать надлежащим образом. Для приготовления раствора «пиранья» добавьте 75 milliliters концентрированной серной кислоты в сухой стакан, а затем осторожно добавьте 25 milliliters 30% hydrogen peroxide.

Раствор быстро нагревается до температуры выше 100 °C, после чего в нем выдерживают сухие покровные стекла в течение 15 минут. После инкубации в растворе «пиранья» покровные стекла погружают в очищенную воду, а затем промывают по одной минуте с каждой стороны. Затем покровные стекла высушивают с помощью вакуумного насоса для удаления остатков очищенной воды.

Дайте раствору «пиранья» остыть и перелейте его в контейнер для отходов раствора «пиранья», который находится в вытяжном шкафу с неплотно закрытой крышкой и соответствующей маркировкой для формирования бислоев. В нашей лаборатории используются двухкамерные системы bi FCS, преимуществом которых является встроенный подогрев. Система FCS two установлена на основании из нержавеющей стали, которое зажимает микрофлюидный коллектор с верхней прокладкой толщиной 0,5 millimeter и предметное стекло с микроакведуком, поверхность которого с одной стороны покрыта оксидом индия-олова для нагрева, а с другой имеет флюидный желоб.

Для сборки проточной кюветы и формирования плоских бислоев используются безпылевая прокладка толщиной 0,25 мм, определяющая высоту проточной камеры, и круглое покровное стекло диаметром 40 мм, очищенное раствором «пиранья», на котором формируется бислой. Поместите коллектор трубками вверх на плоскую поверхность. Затем установите прокладку толщиной 0,5 мм так, чтобы отверстия находились над трубками для подачи жидкости, и убедитесь, что она прилегает плотно.

Осторожно поместите слайд микроакведука каналами вверх и убедитесь, что он лежит ровно; не оказывайте на него давления до тех пор, пока не убедитесь, что отверстия в слайде совмещены с микрофлюидными трубками. Затем положите безпыльную прокладку толщиной 0.25 мм с прямоугольным вырезом поверх слайда микроакведука так, чтобы вырез совпадал с флюидными каналами и между ними не оставалось значительных воздушных зазоров. Нанесите до пяти капель суспензии липосом объемом 1 µL на поверхность слайда микроакведука таким образом, чтобы расстояние между центрами каждой капли составляло 2.5 мм. Пять капель липосом могут иметь разный состав, но в данном случае мы сформируем только два бислоя: один без никель-хелатирующих липидов и один с 10% никель-хелатирующих липидов.

После нанесения этих капель осторожно и одним движением опустите покровное стекло на поверхность и как можно быстрее зафиксируйте его зажимом на основании. Капли липосом должны соприкоснуться с покровным стеклом. Этот контакт нельзя разрывать, так как бислои, вероятно, уже сформировались, и любое нарушение может привести к образованию дефектных бислоев.

На данном этапе важно не забыть отметить положения бислоев несколькими небольшими точками туши на предметном стекле, чтобы облегчить позиционирование покровного стекла на микроскопе. Подождите 20 минут, чтобы система пришла в равновесие; переносите все растворы с помощью шприца объемом 20 milliliter, соединенного с гибким жгутом длиной около 20 centimeters и трехходовым краном. Другой порт крана затем соединяют с проточной кюветой коротким отрезком трубки, чтобы минимизировать мертвый объем между краном и проточной кюветой.

Заполните шприц физиологическим раствором с буфером Хенкса, содержащим хлорид магния, хлорид кальция, глюкозу и человеческий сывороточный альбумин. Пропустите раствор через трубку и трехходовой кран, чтобы удалить все пузырьки воздуха. Затем подключите шприц к проточным кюветам и одним движением прокачайте 5 mL раствора, следя за тем, чтобы пузырьки воздуха не проходили через бислой.

Теперь, когда бислои готовы, в них можно вводить белки с His-тегом. Сначала бислой необходимо блокировать казеином и нагрузить никелем. Наполните шприц объемом 1 мл раствором казеина и ионов никеля, затем подсоедините его к боковому порту, следя за тем, чтобы внутри не осталось пузырьков воздуха.

После введения раствора подождите 20 минут для обеспечения полного блокирования. Затем промойте систему от блокирующего раствора, используя H-B-S-H-S-A из шприца объемом 20 milliliter. Теперь введите 0.5 milliliters раствора H-B-S-H-S-A, содержащего ICAM one с полигистидиновым тегом и IEK.

В данном эксперименте ICAM-1 мечены SCI-5. Таким образом, за взаимодействиями LFA-1 и ICAM-1 можно наблюдать, визуализируя перестройку ICAM-1 в бислое. Оставьте белок на 30 минут для связывания с заряженным никелем бислоем; в это время белок будет адсорбироваться на бислое. Закрепите проточную кювету в инвертированном микроскопе с помощью специальной вставки для предметного столика.

Затем подключите электронный блок нагрева, чтобы система достигла равновесия при 37 °C. Используя нанесенные ранее метки, установите проточную кювету таким образом, чтобы объектив был совмещен с одним из бислоев, и с помощью интерференционной отражательной микроскопии определите фокальную плоскость, фокусируясь на отраженном изображении полевой диафрагмы. В завершение вымойте несвязавшийся ICAM-1 из проточных кювет.

Получите флуоресцентные изображения бислоя в канале ICAM 1 в режимах turf M и widefield. Это необходимо для подтверждения связывания ICAM 1 с бислоем с никелевым покрытием по сравнению с бислоем без никеля. Теперь проточная ячейка готова к введению клеток.

Для данной демонстрации мы будем использовать трансгенные Т-клетки с рецептором Т-клеток ND, трансдуцированные ретровирусом ENC, кодирующим GFP-Zap70. Промойте клетки один раз раствором HBSS с добавлением HSA, затем инкубируйте их с Fab-фрагментом антитела к рецептору Т-клеток, меченным Alexa 568, чтобы мы могли отслеживать микрокластеры TCR. Через 15 минут разведите клетки в соотношении 1:10. Это позволит снизить концентрацию антитела Alexa 568 до уровня, при котором оно не будет мешать TIRF-микроскопии, но при этом обеспечит насыщение рецепторов Т-клеток по мере того, как изначально связавшиеся Fab-фрагменты начнут диссоциировать. Затем введите их в проточную кювету.

Мы визуализируем иммунологический синапс в трехцветном режиме Turf M. Это включает формирование взаимодействия LFA-1 и ICAM-1, образование кластеров TCR и c-SMAC, а также устойчивое формирование микрокластеров TCR, которые привлекают GFP-ZAP-70. Некоторые из этих результатов очевидны непосредственно в процессе получения изображений, тогда как другие потребуют последующего анализа для полной оценки.

Итак, мы только что продемонстрировали вам, как использовать поддерживаемые планарные бислои для изучения иммунологического синапса. Для успешного проведения этих экспериментов крайне важно, чтобы Т-клетки находились в отличном состоянии, а фосфатно-солевой буферный раствор (PBS) не предназначен для длительного культивирования Т-клеток. Поэтому вам следует извлечь клетки из культуры, поместить их в данную среду и приступить к работе незамедлительно.

Если вам потребуется провести более длительные эксперименты, вместо фосфатно-солевого буферного раствора можно использовать некоторые очень эффективные составы безсывороточных сред. Это позволит поддерживать жизнеспособность клеток значительно дольше, если вы планируете изучать отдаленные конечные точки, такие как продукция цитокинов или пролиферация T-клеток. На этом всё.

Благодарим за просмотр и желаем успехов в ваших экспериментах.