7.16: Recombinaison site-spécifique et variation de phase
Du fait que les segments d'ADN soient coupés et réorganisés d'une manière spécifique à la direction, la recombinaison site-spécifique est apparue comme une technique de génie génétique efficace. Les recombinases Flippase (FLp) et Cre, sont deux membres de la famille des tyrosine recombinases dérivée de bactériophages, qui sont utilisées pour médier les insertions d'ADN spécifiques à un site, les suppressions et l'expression ciblée de protéines dans les lignées cellulaires de mammifères.
Les sites de reconnaissance de la recombinase Cre appelés sites LoxP ont une longueur d'environ 34 paires de bases. Les sites LoxP contiennent des séquences palindromiques de 13 pb, ce qui signifie que la séquence nucléotidique est la même dans les deux directions à savoir 5’ à 3’ et 3’ à 5’. La recombinaison site-spécifique médiée par les recombinases Cre est l'une des méthodes les plus populaires utilisées dans la création de souris transgéniques avec des mutations acquises. L'utilisation de variantes thermostables de la recombinase Cre avec des promoteurs spécifiques aux tissus permet un contrôle spatial sur l'expression et l'action de la recombinase Cre. Par exemple, le fait de placer un promoteur Cadherin spécifique au rein en amont du gène Cre permet à l'enzyme d'être exprimée uniquement dans les tissus rénaux. Pour le contrôle temporel de l'activité de Cre, le gène de l'enzyme est fusionné avec un domaine de liaison au ligand de sorte que l'enzyme ne s'exprime qu'en présence du ligand spécifique.
Une limitation majeure de l'utilisation de la recombinaison spécifique au site comme outil d'édition du génome est que le ou les sites de recombinaison cibles doivent être insérés en premier ou doivent être présents par hasard. Si un site génomique congruent avec le site de reconnaissance enzymatique peut être présélectionné, les recombinases peuvent être utilisées avec une cible spécifique “ faite sur mesure”. Des études récentes ont utilisé la mutagenèse et le brassage de gènes pour concevoir des variantes Flp qui peuvent reconnaître fonctionnellement des sites avec des mutations combinatoires. Les résultats sont prometteurs pour les futures itérations du brassage de gènes qui peuvent produire des variantes Flp plus spécifiques et peuvent être utilisés commercialement comme outil moléculaire pour la conception de grands génomes.
