Summary
एकतरफा hindlimb ischemia के शामिल होने के लिए शल्य चिकित्सा की प्रक्रिया, लेजर डॉपलर छिड़काव इमेजिंग ischemia के द्वारा पुष्टि के साथ प्रदर्शन किया है.
Abstract
संयुक्त राज्य अमेरिका में, परिधीय धमनी रोग (पैड) के बारे में 10 मिलियन व्यक्तियों को प्रभावित करता है, और भी प्रचलित दुनिया भर है. रोगसूचक राहत के लिए चिकित्सा उपचार सीमित कर रहे हैं. शल्य चिकित्सा या endovascular हस्तक्षेप कुछ व्यक्तियों के लिए उपयोगी होते हैं, लेकिन दीर्घकालिक परिणाम अक्सर निराशाजनक रहे हैं. एक परिणाम के रूप में, वहाँ नए उपचारों के विकास के लिए पैड के इलाज के लिए एक की जरूरत है. murine hindlimb ischemia तैयारी पैड के एक मॉडल है, और नए उपचारों के परीक्षण के लिए उपयोगी है. जब कोरोनरी या प्रमस्तिष्क धमनी ligation के रूप में ऊतक ischemia के अन्य मॉडलों की तुलना में, और्विक धमनी ligation इस्कीमिक ऊतकों की एक सरल मॉडल के लिए प्रदान करता है. इस मॉडल के अन्य लाभ और्विक धमनी और मृत्यु दर कम करने के लिए उपयोग में आसानी रहे हैं.
इस वीडियो में, हम एकतरफा hindimb ischemia के murine मॉडल के लिए कार्यप्रणाली प्रदर्शित करता है. बनाने और मूल्यांकन मॉडल के लिए विशिष्ट सामग्री और प्रक्रियाओं लेजर डॉपलर इमेजिंग द्वारा अंग छिड़काव का आकलन सहित, वर्णित किया जाएगा. इस प्रोटोकॉल भी प्रत्यारोपण के लिए और कोशिकाओं है, जो हुआंग एट अल द्वारा प्रदर्शन किया है. एक गैर इनवेसिव ट्रैकिंग का उपयोग किया जा सकता है .
Protocol
1. एकतरफा Hindlimb Ischemia की प्रेरण
- ठीक बताया संदंश, बताया संदंश, वसंत कैंची, शल्य चिकित्सा कैंची, सुई धारक, और retractor: शल्य चिकित्सा के इस ऑपरेशन के लिए आवश्यक उपकरण शामिल हैं. हम अपने स्वयं के एक क्लिप का उपयोग retractor क्योंकि यह व्यावसायिक रूप से उपलब्ध retractors की तुलना में छोटे है. इन उपकरणों एक autoclave या एक गर्म मनका अजीवाणु बनानेवाला पदार्थ से सर्जरी से पहले से जीवाणुरहित. एक दाग़ना उपकरण और बाँझ ठीक बताया कपास swabs भी इस सर्जरी के लिए आवश्यक हो जाएगा. यह अनुशंसा की जाती है कि उपकरण के रूप में की प्रक्रिया के दौरान आवश्यक सुझावों पर फिर से निष्फल हो.
- जब औजार तैयार हैं, संज्ञाहरण प्रेरण चेंबर में 1-3% 1L/min की एक प्रवाह दर पर 100% ऑक्सीजन में isoflurane युक्त माउस जगह है.
- प्रेरण कक्ष में माउस छोड़ दो जब तक यह बाह्य stimuli करने के लिए अनुत्तरदायी है. फिर प्रेरण कक्ष से पशु हटा दें. यह बॉक्स से संवेदनाहारी पहले फ्लश ढक्कन खोलने के लिए, ऑपरेटर isoflurane जोखिम कम करने की सिफारिश की है.
- तो लापरवाह स्थिति में पूर्व ऑपरेटिंग मेज पर जानवर और जगह isoflurane की एक सतत प्रवाह से कनेक्ट. एक इलेक्ट्रिक शेवर का उपयोग, hindlimb से बालों को हटाने. अच्छी तरह से बालों को हटाने के लिए बालों को हटाने क्रीम लागू.
- ऑपरेटिंग मेज पर एक लिपटी गर्म पैड पर लापरवाह स्थिति में माउस प्लेस, और यह isoflurane की एक सतत प्रवाह से कनेक्ट. विस्तृत करें और टेप का एक टुकड़ा के साथ hindlimb सुरक्षित. एक बार hindlimb सुरक्षित है, तीन बारी betadine शराब और scrubs के साथ त्वचा पोछ लो. शल्य चिकित्सा की प्रक्रिया के शेष के लिए, 10X या 20X आवर्धन पर एक विच्छेदन माइक्रोस्कोप का उपयोग करने के लिए hindlimb क्षेत्र के एक बढ़े हुए दृश्य प्राप्त.
- ठीक संदंश और शल्य कैंची का प्रयोग, औसत दर्जे का जांघ की ओर घुटने से त्वचा की एक चीरा लगभग 1 सेमी लंबे समय है, बनाने.
- फॉस्फेट का उपयोग खारा buffered (पीबीएस) ठीक बताया कपास swabs सिक्त, धीरे दूर वसा जांघ की मांसपेशियों आसपास के ऊतकों ब्रश.
- अगला, transversely दाग़ना को काटकर अलग कर देना और उपचर्म वसा ऊतकों के माध्यम से काटना अंतर्निहित और्विक धमनी प्रकट लागू होते हैं.
- घाव खुला और कम सिरा vasculature की एक बेहतर विचार प्राप्त करने के एक retractor का प्रयोग करें.
- झिल्लीदार ऊरु म्यान के माध्यम से ठीक संदंश और एक ठीक बताया कपास झाड़ू से साफ़ करना, धीरे पियर्स का उपयोग करने के लिए neurovascular बंडल बेनकाब.
- फिर, ठीक संदंश और कपास झाड़ू के एक स्वच्छ सेट का उपयोग कर टुकड़े करना, और ऊरु और कमर के पास प्रॉक्सिमल स्थान पर नस तंत्रिका से और्विक धमनी अलग. विच्छेदन के बाद, 7-0 और्विक धमनी के प्रॉक्सिमल अंत के नीचे रेशम सीवन का एक कतरा गुजरती हैं. डबल समुद्री मील का उपयोग प्रॉक्सिमल और्विक धमनी रोक देना. प्रॉक्सिमल के रूप में पोत पर क्रम में करने के लिए दूसरा टाई और एक बीच खंड है कि transected हो जाएगा के लिए लंबाई छोड़ संभव के रूप में घाव में टाई प्लेस.
- घुटने के लिए बाहर का करीबी स्थान पर ऊरु नस से अलग और्विक धमनी. घुटने की चक्की धमनी प्रॉक्सिमल और्विक धमनी के बाहर का अंत नीचे 7-0 सिवनी का एक कतरा दर्रा. डबल समुद्री मील का उपयोग पोत रोक देना.
- डबल सिर्फ समुद्री मील का पहला सेट करने के लिए समीपस्थ समुद्री मील की एक दूसरे सेट के साथ बाहर और्विक धमनी रोक देना. Sutures का यह दूसरा सेट लेनदेन की प्रक्रिया के दौरान धमनी मनोरंजक के लिए इस्तेमाल किया जाएगा.
- इसी तरह, मनोरंजक प्रयोजनों के लिए, डबल सिर्फ समुद्री मील का पहला सेट करने के लिए बाहर का समुद्री मील की एक दूसरे सेट के साथ प्रॉक्सिमल और्विक धमनी रोक देना.
- ठीक बताया कपास झाड़ू से साफ़ करना और वसंत कैंची की एक जोड़ी के साथ बाहर का और प्रॉक्सिमल गाँठों के बीच और्विक धमनी के खंड आड़ा काट. ऊरु नस दीवार बेध नहीं सावधानी बरतें.
- Retractor निकालें और 5-0 Vicryl sutures का उपयोग चीरा बंद. इन sutures के लिए एक बाद में समय पर हटाया जा की जरूरत नहीं है, के रूप में वे अपने दम पर भंग.
- एक बार चीरा बंद कर दिया है, वसूली पिंजरे में लिपटी गर्म पैड के शीर्ष पर जानवरों की जगह है और जाग जब तक निगरानी लगातार.
- के बाद 1 घंटे के लिए पशु बरामद किया है, लेजर डॉपलर रक्त छिड़काव कदम के साथ आगे बढ़ने के क्रम में ischemia के प्रेरण की पुष्टि.
2. लेजर डॉपलर रक्त छिड़काव
- लेजर डॉपलर छिड़काव कदम शुरू करने के लिए, संज्ञाहरण प्रेरण चेंबर में 1-3% 1L/min की एक प्रवाह दर पर 100% ऑक्सीजन में isoflurane युक्त माउस जगह है.
- प्रेरण कक्ष में माउस छोड़ दो जब तक यह बाह्य stimuli करने के लिए अनुत्तरदायी है. फिर प्रेरण कक्ष से पशु हटा दें. यह बॉक्स से संवेदनाहारी पहले फ्लश ढक्कन खोलने के लिए, ऑपरेटर isoflurane जोखिम कम करने की सिफारिश की है.
- जानवर isoflurane के सतत प्रवाह से जुड़े पूर्व ऑपरेटिंग मेज पर रखें. फिर एक बिजली आवश्यक के रूप में बाल हटाने क्रीम के द्वारा पीछा किया शेवर का उपयोग करने hindlimb से बालों को हटाने.
- बालों को हटाने के बाद,isoflurane के सतत प्रवाह के अंतर्गत 5 मिनट के लिए एक 37 डिग्री सेल्सियस गर्म सतह पर जानवरों की जगह है. कोर तापमान मॉनिटर euthermia सुनिश्चित करने के लिए, के रूप में तापमान परिवर्तन स्पष्ट रूप से छिड़काव प्रभावित करेगा.
- 5 मिनट के बाद, एक गैर चिंतनशील जैसे हरे रंग का कपड़ा सतह प्रकाश को अवशोषित, isoflurane की एक सतत प्रवाह से जुड़ा पर लापरवाह स्थिति में जानवरों की जगह. Hindlimbs बढ़ाएँ.
- अगला, लेजर डॉपलर imager और अधिग्रहण सॉफ्टवेयर पर बारी और सॉफ्टवेयर इनिशियलाइज़. देखने और संकल्प के क्षेत्र के आकार निर्दिष्ट करें. यह सबसे अच्छा है देखने और पिक्सेल घनत्व के क्षेत्र पशुओं के बीच लगातार रखने के क्रम में भविष्य के विश्लेषण आसान बनाने के.
- एक नई फ़ाइल खोलें. छवि डेटा प्राप्त शुरू करने के लिए शुरू प्रेस. आम तौर पर, imager स्वचालित रूप से माउस की दूरी का पता लगाता है, लेकिन यदि संकेत किया जाए, जानवर के imager करने के लिए दूरी निर्दिष्ट. लेजर देखने के क्षेत्र की सीमाओं को दिखाने के लिए और फिर डेटा प्राप्त शुरू होगा.
- अधिग्रहण पूरा होने के बाद, छवि रंग की एक सीमा है कि पैरों को रक्त छिड़काव के स्तर का संकेत कर रहे हैं दिखाने के लिए शुरू हो जाएगा. रंग एक विशिष्ट छिड़काव श्रृंखला के लिए सेट किया जा सकता करने के लिए बेहतर पशुओं के बीच डेटा की तुलना.
- जब डाटा अधिग्रहण पूरा हो गया है, तो फ़ाइल सहेजें.
- फिर वसूली पिंजरे के लिए जानवरों की वापसी और जानवर जाग जब तक निगरानी लगातार.
- डेटा का विश्लेषण करने के लिए, विश्लेषण सॉफ्टवेयर में सीमा समायोजन का उपयोग करने के लिए किसी भी पृष्ठभूमि शोर घटाना. 0.2 की एक सीमा आमतौर पर एक उचित मूल्य है. ब्याज की 2 क्षेत्रों, या ROIs है कि प्रत्येक hindlimb क्षेत्र को कवर का चयन करें. स्थलों की एक किस्म का अंग और जानवरों के बीच रॉय मानकीकरण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. तो मतलब है और रॉय में छिड़काव परिवर्तनशीलता का निर्धारण करते हैं. छिड़काव और इस्कीमिक अंग और नियंत्रण अंग के बीच छिड़काव अनुपात फर्क करें तो आसानी से निर्धारित किया जा सकता है.
- यह प्रक्रिया समय पर hindlimb छिड़काव में परिवर्तन का पालन करने के लिए दोहराया जा सकता है. एक वांछित समय बिंदु पर, पशु ऊतक समारोह और छिड़काव छवि डेटा की तुलना की मूल्यांकन के लिए euthanized किया जा सकता है.
3. प्रतिनिधि परिणाम:
hindlimb vasculature की शरीर रचना चित्र 1 2 में दिखाया गया है. और्विक धमनी explantation के बाद hindlimb के एक प्रतिनिधि आरेख चित्रा 2 में दिखाया गया है. Ischemia के hindlimb के लिए प्रेरण की पुष्टि करने के लिए, लेजर डॉपलर छिड़काव छवि विश्लेषण इस्कीमिक अंग रक्त के प्रवाह में एक नाटकीय कमी को दर्शाता है, नियंत्रण अंग की तुलना में, के रूप में 3 चित्र में दिखाया गया है.
चित्रा 1 hindlimb vasculature के एनाटॉमी. तारांकन hindlimb ischemia के शामिल होने के लिए ligation के स्थानों से संकेत मिलता है.
चित्रा 2 प्रतिनिधि और्विक धमनी के हटाने के बाद प्रॉक्सिमल और डिस्टल साइटों पर और्विक धमनी के ligation के बाद hindlimb का शरीर रचना विज्ञान दिखा आरेख.
चित्रा 3. लेजर डॉपलर ischemia के बाईं hindlimb (तीर द्वारा संकेत) के लिए प्रेरण के पहले और बाद में रक्त के प्रवाह को दिखा छवियों .
Discussion
वहाँ कुछ परिवर्तनशीलता के स्रोतों पर विचार करने के लिए है जबकि योजना और hindlimb ischemia मॉडल प्रदर्शन कर रहे हैं. सबसे पहले, ischemia के स्तर ligation के पक्ष शाखाओं के संबंध में स्थान के अनुसार भिन्न हो सकते हैं. इसलिए, मॉडल की निरंतरता के लिए, पालतू जानवर धमनी ligation का एक ही स्तर से गुजरना चाहिए. Ischemic वसूली में परिवर्तनशीलता का एक अन्य स्रोत पशुओं की उम्र से संबंधित है, जवान जानवरों (6-8 सप्ताह पुराने) को तेजी से और अधिक पूर्ण बड़े पशुओं (8-10 महीने पुरानी) की तुलना में वसूली दर होने के साथ, के रूप में (यानी hemodynamic द्वारा मूल्यांकन लेजर डॉपलर) छिड़काव या कार्यात्मक (यानी ट्रेडमिल परीक्षण) के उपाय. अध्ययन में जो एक एक angiogenic एजेंट का आकलन है के लिए, यह बेहतर होगा बड़े पशुओं का उपयोग करने के लिए, हो सकता है क्योंकि समूहों के बीच एक बड़ा अंतर एक चिकित्सकीय हस्तक्षेप के साथ मनाया जा सकता है है. इसके विपरीत, जिसमें एक एक विरोधी angiogenic कारक का आकलन है अध्ययन के लिए, यह बेहतर हो छोटे जानवरों का उपयोग करने के लिए प्रभाव आकार 3 को अधिकतम कर सकते हैं.
अगर सही ढंग से प्रदर्शन किया, वहाँ कम से कम खून बह रहा, संक्रमण, या मृत्यु दर के रूप में ऐसे जटिलताओं होना चाहिए. यदि खून बह रहा ऊरु नस या अन्य जहाजों, एक बाँझ कपास के साथ मध्यम दबाव के आकस्मिक व्यवधान द्वारा होता है, इत्तला दे दी applicator धुंध या रक्तस्राव के साइट करने के लिए लागू किया जाना चाहिए जब तक खून बह रहा बंद हो जाता है. संक्रमण के लक्षण दिखा पशु विरोधी संक्रामक एजेंटों के साथ इलाज किया जाना चाहिए. महत्वपूर्ण कोथ प्रदर्शन पशु beeuthanized करने के लिए आवश्यकता हो सकती है. इस जटिलता बड़े पशुओं में ज्यादा आम है, और BALB ग 4 चूहों जैसे कुछ उपभेदों में. इसके अलावा, hindlimb ischemia उदारवादी दर्द के लिए हल्के मॉडल का कारण हो सकता है. इसलिए, buprenorphine या carprofen जैसे दर्दनाशक दवाओं के रूप में दर्द के उपचार के के लिए आवश्यक प्रशासित किया जाना चाहिए IACUC की सिफारिशों के अनुसार,.
अंत में, हम hindlimb ischemia के एक murine मॉडल में पैड का अध्ययन करने के लिए एक सरल और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य विधि का प्रदर्शन किया. hindlimb ischemia मॉडल लेजर डॉपलर इमेजिंग विश्लेषण के साथ संवहनी विकृतियों के अध्ययन के लिए और चिकित्सकीय उम्मीदवारों का आकलन करने के लिए एक उत्कृष्ट सिस्टम है.
Acknowledgments
लेखक Andrea Axtell, सातोशी Itoh, एमडी, जेफ Velotta, एमडी, अनुदान होयत, रॉबर्ट सी. रॉबिंस, एमडी, जिन यू, एमडी, टिम डोयल, पीएचडी, और स्टैनफोर्ड तकनीकी सहायता के लिए छोटे पशु इमेजिंग कोर धन्यवाद. लेखकों को भी AM Bickford इंक पशु चिकित्सा उपकरणों के समर्थन के लिए धन्यवाद. इस शोध स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थानों से अनुसंधान अनुदान (HL-75,774 R01, R01 CA098303, HL085743 R21, HL087746 1K12), कैलिफोर्निया तंबाकू कैलिफोर्निया विश्वविद्यालय (15IT 0257 और 1514RT-0169) से संबंधित रोग अनुसंधान कार्यक्रम के द्वारा समर्थित किया गया , और पुनर्योजी चिकित्सा के लिए कैलिफोर्निया इंस्टीट्यूट (RS1 ००,१८३). राष्ट्रीय राजमार्ग अमेरिकन हार्ट एसोसिएशन से एक फैलोशिप द्वारा समर्थित है.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Surgical Tools | Tool | Fine Science Tools | ||
| Constix Cotton Swabs | Tool | Contec | SC-4 | |
| Betadine (Povidone-iodine) | Reagent | PDI | ||
| 70% alcohol | Reagent | Kendall | ||
| Phosphate Buffered Saline | Reagent | Invitrogen | ||
| 7-0 silk suture | Tool | Genzyme | ||
| 5-0 vicryl suture | Tool | Ethicon Inc. | ||
| Electric shaver | Tool | GE Healthcare | ||
| Cautery | Tool | Baxter Internationl Inc. | ||
| Laser Doppler and PeriScan PIM 3 System | Equipment | Perimed |
References
- Huang, N. F., Niiyama, H., De, A., Cooke, J. P., , Transplantation and non-invasive tracking of embryonic stem cell-derived endothelial cells for treatment of hindlimb ischemia. J Vis Exp. , (2008).
- Cook, M. J. The anatomy of the laboratory mouse. , Academic Press. New York. (1976).
- Niiyama, H., Kai, H., Yamamoto, T., Shimada, T., Sasaki, K., Murohara, T., Egashira, K., Imaizumi, T. Roles of endogenous monocyte chemoattractant protein-1 in ischemia-induced neovascularization. J. Am. Coll. Cardiol. 44, 661-666 (2004).
- Dokun, A. O., Keum, S., Hazarika, S., Li, Y., Lamonte, G. M., Wheeler, F., Marchuk, D. A., Annex, B. H. A quantitative trait locus (LSq-1) on mouse chromosome 7 is linked to the absence of tissue loss after surgical hindlimb ischemia. Circulation. 117, 1207-1215 (2008).
