Summary
일방적 hindlimb의 국소 빈혈의 유도에 대한 수술은 레이저 도플러 재관류 이미징에 의해 국소 빈혈의 확인과 증명합니다.
Abstract
미국에서는, 말초 동맥 질환 (PAD)는 만 10 개인에 영향을, 또한 세계적으로 유행이다. 증상 완화 의료 치료가 제한됩니다. 수술이나 endovascular 개입 어떤 개인 유용하지만 장기적인 결과는 종종 실망입니다. 그 결과, PAD를 치료하는 새로운 치료법을 개발하기위한 필요가있다. murine hindlimb의 국소 빈혈 준비는 PAD의 모델, 새로운 치료법을 테스트하는 데 유용합니다. 이러한 관상이나 대뇌 동맥 내고 같은 조직 국소 빈혈의 다른 모델에 비해, 대퇴 동맥 내고는 허혈성 조직의 간단한 모델을 제공합니다. 이 모델의 다른 장점은 대퇴 동맥과 낮은 사망률에 대한 접근의 용이성입니다.
이 비디오에서는, 우리는 일방적 hindimb의 국소 빈혈의 murine 모델에 대한 방법론을 보여줍니다. 모델을 생성하고 평가하기위한 구체적인 자료와 절차는 레이저 도플러 영상으로 사지 재관류의 평가를 포함하여 설명한다. 이 프로토콜은 또한 황 외 의해 증명 세포. 1의 이식과 비침습 추적 이용하실 수 있습니다.
Protocol
1. 일방적 Hindlimb의 국소 빈혈의 유도
- 이 작업에 필요한 수술 도구는 다음과 같습니다 좋은 지적 포셉, 지적 포셉, 스프링 가위, 외과 가위, 바늘 홀더, 그리고 견인기 있습니다. 그것이 상용 견인기보다 작은이기 때문에 우리는 클립을 사용하여 우리 자신의 견인기합니다. 압력솥이나 핫 구슬 살균기 사전 수술 이러한 도구를 소독. 소작 도구 및 살균 좋은 지적 목화 면봉도이 수술을 위해 필요한 것입니다. 이것은 도구로 절차를 수행하는 동안 필요한 끝을 다시 소독하는 것이 좋습니다.
- 도구가 준비되면 1L/min의 흐름 속도 100 % 산소 isoflurane 1~3%을 포함하고있는 마취 유도 챔버에 마우스를 놓으십시오.
- 그것이 외부 자극에 응답하지 않는 때까지 유도 챔버에 마우스를 둡니다. 그런 다음 유도 챔버에서 동물을 제거합니다. 그것은 isoflurane에 운영자 노출을 감소하기 위해 뚜껑을 여는하기 전에 상자에서 마취를 플러시하는 것이 좋습니다.
- 그런 다음 미리 운영 테이블에 위로 향한 위치에 동물을 배치하고 isoflurane의 지속적인 흐름에 연결합니다. 전기 면도기를 사용 hindlimb에서 머리를 제거합니다. 철저하게 머리를 제거하는 제모 크림을 적용합니다.
- 운영 테이블에 draped 온수 패드 위에 부정사 위치에 마우스를 놓고, isoflurane의 지속적인 흐름에 연결합니다. 확장 테이프의 조각으로 hindlimb을 확보. hindlimb가 안전되면 세 번갈아 betadine 및 알코올 스크럽으로 피부를 닦아냅니다. 수술의 나머지 부분은 hindlimb 지역의 확대를 얻을 10X 20X 확대 또는 해부 현미경을 사용합니다.
- 좋은 포셉, 외과 가위를 사용하여 중간 허벅지 향해 무릎에서 약 1cm 길이, 피부의 절개합니다.
- 인산염을 사용하면 생리를 버퍼 (PBS) 허벅지 근육을 둘러싸고있는 피하 지방 조직을 부드럽게 브러시 거리, 괜찮아요 지적 목화 면봉을 moistened.
- 다음 절개 및 기본 대퇴 동맥을 나타내기 위해 피하 지방 조직을 통해 해부하다에 transversely 소작을 적용합니다.
- 상처를 열고 아래쪽 끝단 vasculature의 더 나은 전망을 얻기 위해 견인기을 사용합니다.
- neurovascular 번들을 폭로하는 막의 대퇴 칼집을 통해 부드럽게 잘 포셉과 좋은 지적 면봉, 피어스를 사용하여.
- 그런 다음, 고급 포셉 및 면봉의 클린 세트를 사용하여 절개하다 그리고 사타구니 근처에있는 근위 위치에서 대퇴 정맥과 신경의 대퇴 동맥을 분리. 절개 후, 대퇴 동맥의 근위 끝 아래 7-0 실크 봉합사의 가닥을 전달합니다. 더블 노트를 사용하여 근위 대퇴 동맥을 막다. 두 번째 넥타이 가로 것입니다 개입 세그먼트 길이를 떠나하기 위해 가능한 한 상처에서 근위로 선박에 넥타이를 놓으십시오.
- 무릎에 가까운 말초 위치에서 대퇴 정맥에서 대퇴 동맥을 분리합니다. 오금 동맥 근위 대퇴 동맥의 말초 끝에 아래 7-0 봉합사의 가닥을 전달합니다. 더블 노트를 사용하여 혈관을 막다.
- 노트의 첫 번째 집합에서 불과 근위 더블 노트의 두 번째 세트와 함께 말초 대퇴 동맥을 막다. 봉합의이 두 번째는 거래 절차를 수행하는 동안 동맥을 재밌 위해 사용됩니다.
- 마찬가지로, 재밌 목적 노트의 첫 번째 집합에 단지 말초 더블 노트의 두 번째 세트와 함께 근위 대퇴 동맥을 막다.
- 좋은 지적 면봉과 봄 가위로 말초 및 근위 매듭 사이의 대퇴 동맥의 세그먼트를 가로로 쪼개다. 피어스 대퇴 정맥 벽하지 않는주의하십시오.
- 견인기를 제거하고 5-0 Vicryl 봉합을 사용하여 절개를 닫습니다. 그들이 스스로 해산 이러한 봉합은 나중에 제거할 필요가 없습니다.
- 절개가 폐쇄되면, 복구 새장에 draped 온수 패드의 상단에있는 동물을 장소와 정신까지 지속적으로 모니터합니다.
- 동물은 1 시간 동안 회복 후 국소 빈혈의 유도를 확인하기 위해 레이저 도플러 혈액 관류 단계로 진행하십시오.
2. 레이저 도플러 혈액 관류
- 레이저 도플러 재관류 단계를 시작하려면 1L/min의 흐름 속도 100 % 산소 isoflurane 1-3%을 포함하고있는 마취 유도 챔버에 마우스를 놓으십시오.
- 그것이 외부 자극에 응답하지 않는 때까지 유도 챔버에 마우스를 둡니다. 그런 다음 유도 챔버에서 동물을 제거합니다. 그것은 isoflurane에 운영자 노출을 감소하기 위해 뚜껑을 여는하기 전에 상자에서 마취를 플러시하는 것이 좋습니다.
- isoflurane의 지속적인 흐름에 연결된 사전 운영 테이블에있는 동물을 놓으십시오. 그런 다음 필요에 따라 제모 크림 다음 전기 면도기를 사용하여 hindlimb에서 머리를 제거합니다.
- 머리를 제거 후,isoflurane의 지속적인 흐름에 따라 5 분 37 ° C 온수 표면에 동물을 놓으십시오. 온도 변화가 현저하게 재관류에 영향을하므로, euthermia을 보장하기 위해 핵심 온도를 모니터링합니다.
- 5 분 후에, isoflurane의 지속적인 흐름에 연결된 같은 녹색 색 헝겊으로 비 반사 빛을 흡수 표면에있는 위로 향한 위치에 동물을 놓으십시오. hindlimbs를 확장합니다.
- 다음, 레이저 도플러 영상기 및 수집 소프트웨어를 켜고 소프트웨어를 초기화합니다. 전망 및 해결 분야의 크기를 지정합니다. 그것은 미래의 분석을 쉽게하기 위해 동물 사이에보기 및 픽셀 밀도 분야가 일관성이 유지하는 것이 좋습니다.
- 새 파일을 엽니다. 이미지 데이터를 획득 시작 시작 버튼을 누르십시오. 일반적으로, 영상기 자동으로 마우스의 거리를 감지하지만, 메시지가 표시되면, 영상기에 동물의 거리를 지정합니다. 레이저 볼 분야의 경계를 표시하고 데이터를 수집하기 시작합니다.
- 인수가 완료되면 이미지가 다리에 혈액 관류의 수준을 나타내는 아르 색상의 범위를 보여주기 시작합니다. 색상은 더 나은 동물 사이의 데이터를 비교하기 위해 특정 재관류 범위로 설정할 수 있습니다.
- 데이터 수집이 완료되면 파일을 저장합니다.
- 그런 다음 복구 케이지에 동물을 반환 정신 때까지 지속적으로 동물을 모니터링합니다.
- 데이터를 분석하려면, 어떤 배경 잡음을 빼야하는 분석 소프트웨어에서 임계값 조정을 사용합니다. 0.2의 임계값은 일반적으로 합리적인 가치입니다. 각 hindlimb 영역을 커버 2의 관심 지역, 또는 로아를 선택합니다. 랜드마크의 다양한 손발과 동물 사이의 투자 수익 (ROI)을 표준화하는 데 사용할 수 있습니다. 그런 다음 투자 수익 (ROI)의 의미 재관류와 다양성을 결정합니다. 허혈성 사지 및 제어 사지 사이의 재관류 차이 및 재관류 비율은 다음을 쉽게 확인할 수 있습니다.
- 이 절차는 시간이 지남에 따라 hindlimb 재관류의 변화에 따라 반복 수 있습니다. 원하는 시점에서, 동물은 조직 기능과 재관류 이미지 데이터에 대한 비교 평가 euthanized 수 있습니다.
3. 대표 결과 :
hindlimb vasculature의 해부 그림 1 2에 표시됩니다. 대퇴 동맥 explantation 후 hindlimb의 대표 다이어그램 그림 2에 표시됩니다. 그림 3과 같이 hindlimb에 국소 빈혈의 유도를 확인하려면, 레이저 도플러 재관류 이미지 분석, 제어 사지 비교, 허혈성 사지에 혈액의 흐름에서 극적인 감소를 보여줍니다.
그림 1. hindlimb의 vasculature의 해부학. 별표 hindlimb 국소 빈혈의 유도에 대한 결합의 위치를 나타냅니다.
그림 2. 대퇴 동맥의 제거 후 근위 및 말초 사이트에있는 대퇴 동맥의 결합 후 hindlimb의 해부를 보여주는 대표 다이어그램.
왼쪽 hindlimb (화살표로 표시)에 국소 빈혈의 유도 전후 혈액 흐름을 보여주는 그림 3. 레이저 도플러 이미지.
Discussion
계획 및 hindlimb 국소 빈혈 모델을 수행하는 동안 고려해야 할 다양성의 일부 소스가 있습니다. 첫째, 국소 빈혈의 수준은 사이드 지점의와 관련하여 결합의 위치에 따라 다를 수 있습니다. 따라서 모델의 일관성을 위해, 동물 동맥 내고 같은 수준을 받아야한다. 허혈성 회복 다양성의 또 다른 원본이 세 동물 (80~10개월 세)보다 빠르고보다 완벽한 복구 속도를 가지고 젊은 동물 (6~8주 세)와 함께, 동물의 연령과 관련이로 hemodynamic (예에 의해 평가 레이저 도플러 재관류) 또는 기능 (예 : 러닝 머신 테스트) 측정합니다. 그룹 사이에 큰 차이가 치료 개입과 함께 관찰 수 있기 때문에 하나 angiogenic 에이전트를 평가되는 연구는, 기존의 동물을 사용하는 것이 바람직있을 수 있습니다. 반대로 하나가 안티 angiogenic 요인을 평가하고있는 연구, 그것은 효과가 크기 3 극대화하기 위해 어린 동물을 사용하는 것이 바람직있을 수 있습니다.
올바르게 수행할 경우, 출혈, 감염, 또는 사망 등과 같은 최소한의 합병증이있을 것입니다. 출혈은 대퇴 정맥 또는 다른 선박, 멸균 면봉과 적당한 압력의 사고로 장애가 발생하면 출혈이 멈출 때까지 작은 주걱이나 거즈가 출혈의 사이트에 적용해야 날붙이. 감염의 징후를 보여주는 동물은 안티 - infective 에이전트로 치료해야합니다. 중요한 진물을 전시 동물 beeuthanized해야 할 수도 있습니다. 이 합병증은 나이가 동물보다 일반적인 있으며, 이러한 BALB C 마우스 4와 같은 몇 가지 변종, 인치 또한, hindlimb의 국소 빈혈 모델은 중간 고통에 온화 발생할 수 있습니다. 통증 치료를 위해 필요한만큼 따라서 같은 buprenorphine 또는 carprofen과 같은 진통제는 IACUC의 권고에 따라 관리되어야합니다.
결론적으로, 우리는 hindlimb 국소 빈혈의 murine 모델 PAD 공부를위한 간단하고 재현성 방법을 증명하고있다. 레이저 도플러 영상 분석 hindlimb의 국소 빈혈 모델은 혈관 pathologies를 공부 및 치료 후보를 평가하기위한 훌륭한 시스템입니다.
Acknowledgments
저자 안드레아 액스텔, 사토시 이토, MD, 제프 Velotta, MD, 그랜트 호이트, 로버트 C. 로빈스, MD, 진 유, MD, 팀 도일, 박사, 그리고 기술 지원을위한 스탠포드 작은 동물 이미징 핵심 주셔서 감사합니다. 저자는 또한, 수의 장비의 지원을 오전 비크포드 (주) 감사합니다. 이 연구는 국립 보건원에서 연구 기금 (R01 HL - 75774, R01 CA098303, R21 HL085743, 1K12 HL087746), 캘리포니아 대학 (15IT - 0257 및 1514RT - 0169)의 캘리포니아 담배 관련 질병 연구 프로그램에 의해 지원되었다 및 재생 의료 (RS1 - 00183)의 캘리포니아 연구소. NH는 미국 심장 협회에서 친교에 의해 지원됩니다.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Surgical Tools | Tool | Fine Science Tools | ||
| Constix Cotton Swabs | Tool | Contec | SC-4 | |
| Betadine (Povidone-iodine) | Reagent | PDI | ||
| 70% alcohol | Reagent | Kendall | ||
| Phosphate Buffered Saline | Reagent | Invitrogen | ||
| 7-0 silk suture | Tool | Genzyme | ||
| 5-0 vicryl suture | Tool | Ethicon Inc. | ||
| Electric shaver | Tool | GE Healthcare | ||
| Cautery | Tool | Baxter Internationl Inc. | ||
| Laser Doppler and PeriScan PIM 3 System | Equipment | Perimed |
References
- Huang, N. F., Niiyama, H., De, A., Cooke, J. P., , Transplantation and non-invasive tracking of embryonic stem cell-derived endothelial cells for treatment of hindlimb ischemia. J Vis Exp. , (2008).
- Cook, M. J. The anatomy of the laboratory mouse. , Academic Press. New York. (1976).
- Niiyama, H., Kai, H., Yamamoto, T., Shimada, T., Sasaki, K., Murohara, T., Egashira, K., Imaizumi, T. Roles of endogenous monocyte chemoattractant protein-1 in ischemia-induced neovascularization. J. Am. Coll. Cardiol. 44, 661-666 (2004).
- Dokun, A. O., Keum, S., Hazarika, S., Li, Y., Lamonte, G. M., Wheeler, F., Marchuk, D. A., Annex, B. H. A quantitative trait locus (LSq-1) on mouse chromosome 7 is linked to the absence of tissue loss after surgical hindlimb ischemia. Circulation. 117, 1207-1215 (2008).
