תמונה-Induced cross-linking של חלבונים ללא שינוי (PICUP) מאפשר אפיון של התפלגות גודל oligomer תערובות חלבון metastable. אנו מדגימים יישום PICUP שלושה פפטידים נציג amyloidogenic 40 - ו 42-שאריות צורות של עמילואיד β-חלבון, קלציטונין ו פפטיד לשלוט הורמון גדילה גורם משחרר.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
תמונה-induced cross-linking של חלבונים ללא שינוי (PICUP) יישומית כדי פפטידים Amyloidogenic
במאמר זה
סיכום
תקציר
הרכבה של חלבונים amyloidogenic לתוך oligomers רעילים הינה אירוע מכונן בפתוגנזה של מחלות misfolding חלבון, כולל אלצהיימר, פרקינסון, ומחלות של הנטינגטון, תורשתיות טרשת לרוחב amyotrophic, וסוכרת מסוג 2. בשל אופי metastable של מכלולים אלה חלבון, קשה להעריך את גודל oligomer שלהם הפצה כמותית תוך שימוש בשיטות קלאסיות, כגון אלקטרופורזה, כרומטוגרפיה, הקרינה, או פיזור אור דינאמי. Oligomers של חלבונים amyloidogenic קיימים תערובות metastable, שבו oligomers לנתק לתוך מונומרים ולשייך לתוך מכלולים גדולים בו זמנית. PICUP מייצב אוכלוסיות oligomer על ידי cross-linking וכאשר בשילוב עם שיטות חלוקה, כגון אלקטרופורזה dodecyl נתרן סולפט ג'ל polyacrylamide (SDS-PAGE) או גודל הרחקת כרומטוגרפיה (SEC), PICUP מספק תמונות קוולנטיים של הפצות גודל oligomer שהיה קיים לפני צלב -linking. לפיכך, PICUP מאפשרת הדמיה ניתוח כמותי של אוכלוסיות חלבון metastable וניתן להשתמש בו כדי לפקח על הרכבה לפענח את יחסי הגומלין בין השינויים ברצף oligomerization
פרוטוקול
1. פפטיד הכנה
- לשקול את ~ 100-200 מיקרוגרם של הפפטיד lyophilized באמצעות microbalance ולהעביר לתוך שכותרתו, סיליקון מצופה, בעלי כושר ספיגה נמוך צינורות microfuge. כאן, אנו משתמשים רצפים האדם של Aβ40, Aβ42, קלציטונין, ואת פוי.
- כאן, אנו משתמשים פפטידים מראש שטופלו 1,1,1,3,3,3-hexafluoro-2-propanol (HFIP) כדי להשיג הומוגניות, במצטבר ללא הכנות. צעד זה הוא הכרחי משום מראש יצרו אגרגטים לגרום להצטברות מהירה של חלבונים amyloidogenic, אשר התוצאה reproducibility העניים בקרב ניסויים 5. שיטו....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
PICUP פותחה במקור כדי ללמוד קומפלקסים חלבונים יציב 2. השיטה יושמה מאוחר ללמוד כמותי של metastable החלבון עמילואיד מכלולים, כולל 10 Aβ, הפריון ומחלות הקשורים PRP Sc 11, ו - α-synuclein 12. הגורמים החשובים ביותר כי יש לקחת בחשבון בעת תכנון הניסוי PICUP הם stoichiometry מגיב, זמן הקרנה, והכנת הליך הדגימה. לשעבר שני נושאים עשויים לדרוש אופטימיזציה אמפירי, ואילו הנושא השני משפיע בעיקר פרשנות של נתונים ניסיוניים. עבור חלבונים amyloidogenic בפרט, קביעה של הפצות ג.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תודות
עבודה זו נתמכה על ידי מענקים AG027818 ו AG030709 מ-NIH / NIA, 2005/2E מן ל לארי Hillblom קרן, IIRG-07-58334 של איגוד האלצהיימר, 07-65798 מקליפורניה המחלקה לבריאות הציבור.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות | |
|---|---|---|---|---|
| מנורת להט Dolan-Jenner בהספק 200W | אחר | Dolan-Jenner Industries | דגם 170-D | החום הנוצר על ידי המנורה–לא ישפיע על הדגימות בתקופות אינקובציה קצרות. |
| גוף מצלמת SLR במידה 35 מ"מ | כלי | Pentax | דגם SP500 | בהגדרות שלנו, אקורדיון (bellows) מחובר לגוף המצלמה כדי לספק תא נוח להקרנת הדגימה המוצבת במרחק של 10 ס"מ ממקור האור. |
| מבחנות PCR שקופות בעלות דפנות דקות | אחרים | Eppendorf | 951010006 supplied by Fisher L22-003-24 | |
| בקבוקוני זכוכית (1.8 מ"ל) | אחר | קימבל צ'ייס | 60940A 2, מסופק על ידי Fisher 03-340-60 | |
| GRF | ריאגנט | Bachem | H-3695 | |
| HFIP | ריאגנט | TCI America | H0424 | יש להשתמש במטולת אדים. |
| אβ40 ו-Aβ42 | ריאגנט | מעבדת הביופולימרים של UCLA | ||
| קלציטונין | ריאגנט | American Peptide | 22-1-10 | |
| טריס(2,2'-ביפירידיל)דיכלורורותניום(II) הקסההידראט | ריאגנט | Sigma-Aldrich | 224758-1G | ערבבו במערבל וורטקס עד שהתמיסה תהיה צלולה. כסו את מבחנת ה-RuBpy בנייר אלומיניום כדי להגן על הריאגנט מאור סביבתי. יש להכין את ה-RuBpy באופן טרי בכל פעם, ויש להשתמש בו בתוך 48 שעות. |
| אמוניום פרסולפיה | ריאגנט | Sigma-Aldrich | A-7460 | ערבבו במכשיר vortex עד שהתמיסה תהיה צלולה. יש להכין את ה-APS טרי בכל פעם, ויש להשתמש בו בתוך 48 שעות. |
| βמרקפטו-–אתנול | ריאגנט | Sigma-Aldrich | M7154-25 ML | ניתן להשתמש כאשר מבוצע ניתוח SDS-PAGE. |
| Tricine SDS Sample Buffer (2x) של Novex | ריאגנט | Invitrogen | LC1676 | |
| XCell <אני>SureLock תא-מיני (Mini-Cell) | כלי | Invitrogen | EI0001 | |
| ג'לי Novex Tricine (10-20%) | אחר | Invitrogen | EC6625B0X | |
| בופר הרצה Novex Tricine SDS (ריכוז 10x) | Invitrogen | LC1675 | ||
| ערכה לצביעת כסף מהירה (Silver Express Staining Kit) | Invitrogen | LC6100 |
מקורות
- Bitan, G. Structural study of metastable amyloidogenic protein oligomers by photo-induced cross-linking of unmodified proteins. Methods Enzymol. 413, 217-236 (2006).
- Fancy, D. A., Kodadek, T.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
