Foto-inducido el entrecruzamiento de las proteínas sin modificar (picup) aplicada a los péptidos amiloidogénicas

Resumen

Foto-inducido de entrecruzamiento de las proteínas sin modificar (picup) permite la caracterización de la distribución del tamaño de oligómero de mezclas de proteínas metaestable. Se demuestra la aplicación de picup a tres péptidos representante amiloidogénica los 40 - y 42-residuo forma de amiloide β-proteína, y la calcitonina, y un péptido de control de la hormona del crecimiento factor de liberación.

Resumen

El ensamblaje de las proteínas amiloidogénica en oligómeros tóxicos es un acontecimiento fundamental en la patogénesis de las enfermedades de mal plegamiento de proteínas, como el Alzheimer, el Parkinson y las enfermedades de Huntington, esclerosis lateral amiotrófica hereditaria, y la diabetes tipo 2. Debido a la naturaleza metaestable de estos conjuntos de proteínas, es difícil evaluar su distribución de tamaño de oligómero cuantitativamente mediante los métodos clásicos, como la electroforesis, cromatografía de dispersión de la luz, fluorescencia, o dinámica. Oligómeros de proteínas amiloidogénica existen como mezclas metaestable, en el que los oligómeros se disocian en monómeros y asociarse en grandes asambleas de forma simultánea. Picup estabiliza la población oligómero por covalentes entrecruzamiento y cuando se combina con los métodos de fraccionamiento, como la electroforesis en gel de dodecil sulfato de sodio poliacrilamida (SDS-PAGE) o el tamaño de cromatografía de exclusión (SEC), ofrece picup instantáneas de la distribución de oligómeros de tamaño que existía antes de cruzar -linking. Por lo tanto, picup permite la visualización y el análisis cuantitativo de las poblaciones de proteínas metaestable y puede ser usado para monitorear el montaje y descifrar las relaciones entre las modificaciones de la secuencia y oligomerización

Protocolo

1. Péptido de preparación

1. Pesar ~ 100-200 mg de péptido liofilizado usando una microbalanza y la transferencia en la etiqueta, revestido con silicio, tubos de microcentrífuga de baja adsorbente. Aquí, nosotros usamos las secuencias humanas de Aβ40, Aß42, calcitonina y GRF.
2. Aquí, nosotros usamos los péptidos pre-tratados con 1,1,1,3,3,3-hexafluoro-2-propanol (HFIP) para obtener homogénea, global sin preparativos. Este paso es necesario porque preformados agregados inducir la agregación de las proteínas de rápida amiloidogénica, que se traducen en una mala reproducibilidad entre los experimentos ^5. Otros métodos como la filtración y la S....

Discusión

Picup fue desarrollado originalmente para estudiar complejos estables de proteínas ^2. El método fue aplicado más tarde para el estudio cuantitativo de las asambleas metaestable proteína amiloide, incluyendo Aß ^10, priones y las enfermedades asociadas a PrP ^{Sc 11,} y α-sinucleína ^12. Los factores más importantes que deben considerarse al diseñar un experimento picup son la estequiometría reactivo, tiempo de irradiación, y el procedimiento de preparación de la muestra. Las dos primeras cuestiones pue.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Lámpara incandescente Dolan-Jenner de 200 W	Otro	Dolan-Jenner Industries	Modelo 170-D	El calor generado por la lámpara d–no afecta las muestras durante períodos cortos de incubación.
cuerpo de cámara réflex de 35 mm	Herramienta	Pentax	modelo SP500	En nuestras condiciones, se acopla un fuelle al cuerpo de la cámara para proporcionar una cámara conveniente para la irradiación de la muestra colocada a 10 cm de distancia de la fuente de luz.
Tubos PCR transparentes de paredes delgadas	Otro	Eppendorf	951010006 suministrado por Fisher L22-003-24
Viales de vidrio (1,8 mL)	Otro	Kimble Chase	60940A 2, suministrado por Fisher 03-340-60
GRF	Reactivo	Bachem	H-3695
HFIP	Reactivo	TCI America	H0424	Utilice en una campana extractora.
Aβ40 y Aβ42	Reactivo	Laboratorio de Biopolímeros de la UCLA
Calcitonina	Reactivo	American Peptide	22-1-10
Tris(2,2-bipiridil)dicrocoruto(II) hexahidrato	Reactivo	Sigma-Aldrich	224758-1G	Agite en vórtex hasta que la solución esté clara. Cubra el tubo de RuBpy con papel de aluminio para proteger el reactivo de la luz ambiental. El RuBpy se prepara fresco cada vez y debe usarse dentro de las 48 h.
Peroxidisulfato de amonio	Reactivo	Sigma-Aldrich	A-7460	Agite en vórtex hasta que la solución esté clara. El APS se prepara fresco cada vez y debe usarse dentro de las 48 h.
β-mercapto–etanol	Reactivo	Sigma-Aldrich	M7154-25 ML	Puede utilizarse cuando se realiza el análisis mediante SDS-PAGE.
Novex Tricine SDS Sample Buffer (2x)	Reactivo	Invitrogen	LC1676
XCell SureLock Mini-célula	Herramienta	Invitrogen	EI0001
Geles Novex Tricine (10-20 %)	Otro	Invitrogen	EC6625B0X
Novex Tricine SDS Running Buffer (10x)		Invitrogen	LC1675
Kit de tinción Silver Express		Invitrogen	LC6100