Micro-drive Array para Crônica In vivo: Fabricação Unidade

Summary

Neste protocolo, demonstramos como fabricar uma matriz de unidade de micro-crônica para gravações eletrofisiológicas em ratos.

Abstract

Gravação de crônicas de grandes populações de neurônios é uma técnica valiosa para estudar a função dos circuitos neuronais em ratos acordados comportando. Dispositivos de gravação leve carregando um conjunto de alta densidade de tetrodes permitir o monitoramento simultâneo da atividade de dezenas a centenas de neurônios individuais. Aqui nós descrevemos um protocolo para a fabricação de uma matriz de unidade-micro com 21 independentemente móveis micro-drives. Este dispositivo tem sido usado com sucesso para gravar a partir de neurônios do hipocampo e cortical em nosso laboratório. Vamos mostrar como preparar um design personalizado, 3-D de base impressa de plástico que conterá o micro-drives. Demonstramos como construir o indivíduo micro-unidades e como montar a matriz drive-micro completo. De preparação da matriz unidade para implantação cirúrgica, tal como a fabricação de tetrodes, carregamento de tetrodes na unidade matriz eo excesso de regulamentação, é coberto em um artigo de vídeo subseqüentes.

Protocol

1. Micro-drive visão série
   
   Uma matriz micro-drive completo é composto por vários componentes principais (Fig. 1):
   1. Um computador projetado base de plástico que contém 21 independentemente móveis micro-drives.
   2. A cânula na parte inferior da base em que um conjunto de tubos de guia estacionário tetrode é coletado.
   3. 21 micro-unidades que são portadores de um tetrode e que podem ser individualmente controlado através de um parafuso.
   4. Uma placa de interface eletrodo de interligação entre tetrodes e pré-amplificadores.
   5. Um cone de proteção (não é mostrado na Figura 1.)
   6. Em um conjunto totalmente montado micro-drive, a base de plástico detém todas as unidades de micro-. Cada unidade micro-carrega um tetrode único. O tetrode é eletricamente conectada à placa de interface eletrodo no topo da matriz micro-drive, e passa através do tubo de guia estacionário para sair para o cérebro, na parte inferior da matriz drive-micro. Girando o parafuso em cada unidade micro-adiantamentos ou retrai o tetrode.


2. Desenho de base de plástico
   
   Nós projetamos a base de montagem a unidade de micro-nos um pacote de software 3-D CAD (SolidWorks). A vantagem deste processo de design in-house é rápida rotatividade e flexibilidade de design. No laboratório Wilson criamos muitas variantes desta parte, voltada para as demandas específicas de cada experimento. O arquivo modelo 3-D é enviado para um bureau de serviços, onde é impresso a partir de uma resina líquida laser-curável usando estereolitografia. Tempo de resposta é tão pouco como dois dias. A peça resultante é leve, reutilizável e pode ser usinado a realização de uma discussão. Neste protocolo, vamos utilizar uma base de unidade que é projetado com um site de gravação única e que possui 21 micro-drives. O arquivo de projeto do SolidWorks é disponibilizado mediante solicitação.



3. Preparação de base de plástico
   
   A base de plástico é transformado para acomodar as unidades de micro-e os parafusos para fixar a placa de interface eletrodo eo cone de proteção. Não é possível qualidade da impressão suave através de furos na base de plástico, portanto, criamos buracos subdimensionado, então expandi-los por perfuração. Alinhe cuidadosamente a broca com o eixo do furo existente antes de perfurar a uma velocidade muito baixa. A broca de velocidade variável / torque funciona bem para esta tarefa.
   1. Faça os furos piloto 21 para a unidade de micro-parafusos (anel externo) usando um pouco # 61.
   2. Perfurar os 21 buracos para os tubos da unidade micro-suporte (o anel interno), utilizando um pouco # 65.
   3. Faça os furos que serão utilizados para fixar a placa de interface eletrodo e cone de proteção usando um pouco milímetros 1,55.
   4. Encaixe uma manga (5 mm de comprimento 20 Ga de parede fina tubos de aço inoxidável) em cada um dos buracos do anel interno usando um par de pinças ou um par de alicates para que ela fique alinhada com a base de plástico. As mangas assegurar um movimento suave dos tubos da unidade micro-apoio.
      
      Em seguida, todos os buracos que irá realizar os parafusos são exploradas. Impresso em plásticos, linha de formação de resultado torneiras em mais durável do que o típico tópicos fio de corte de torneiras. Este estilo de tocar requer furos maiores piloto. Usando um torno do pino de mão para segurar a torneira:
   
   
   5. Toque os buracos para a unidade de micro-parafusos usando uma torneira que corresponde ao tamanho do parafuso a ser utilizado (M1.2x0.25) e um lubrificante seco. Para ajudar a alinhar a torneira com o furo piloto, insira um comprimento de 23 tubos de Ga na manga ao lado dele.
   6. Nosso projeto base de plástico apresenta um acionador de partida da torneira para cada furo de parafuso micro-drive para garantir que o tópicos iniciais não são danificados durante o processo de segmentação. Depois de todos os buracos são segmentadas, esses iniciantes da torneira pode ser facilmente agarrado fora usando uma lâmina de barbear.
   7. Toque os buracos que irá realizar os parafusos para a placa de interface eletrodo eo cone de proteção usando um toque 1-72.


4. Inserção de tubos de guia eletrodo
   
   
   1. Para fazer com que a cânula que contém todos os tubos de guia estacionário eletrodo, corte um pedaço 1,5 centímetros de comprimento de 13 tubos de aço inoxidável e Ga encrespar a superfície com uma roda de moagem dremel para melhorar a adesão pelo acrílico dental.
   2. Insira este cânula no orifício na parte inferior da base de plástico, verifique se ele é co-linear com o eixo vertical da unidade, e prenda-o com acrílico dental ou epóxi. Deixe 5 a 7 mm da cânula expostos para facilitar implantação cirúrgica.
   3. Cortar 21 tubos de eletrodo estacionário guia (flexível poliimida diâmetro, a tubulação interna: 0,0071 ", diâmetro externo: 0,0116") com uma lâmina de barbear para um comprimento de 6 cm.
   4. Alimentar os tubos de guia um de cada vez nas mangas, na parte superior da base da unidade e todo o caminho através da cânula coletor na parte inferior. Verificar visualmente para torções ou excessiva tubos de flexão e substitua se necessário. Para facilitar a inserção e alinhamento paralelo dos tubos guia tetrode, pode-se começar com a primeira alimentação do pacote inteiro de 21 tubos de guia para dentro docoletor de cânula de baixo. Então, um de cada vez, retire um tubo de guia do conjunto e alimentá-lo a partir do topo da base plástica através do buraco que ele deixou para trás no pacote.
   5. Empurre a guia para baixo até que os tubos se estendem apenas 1-2 mm do topo da base de plástico. Aplique uma pequena quantidade de cola de cianoacrilato fina para os tubos como eles saem da cânula coletor, tendo o cuidado de não deixar qualquer fluxo de cola-se na extremidade dos tubos guia.
   6. Use uma lâmina de barbear fresco para cortar o excesso do feixe de tubos de guia na parte inferior da cânula coletor.
   
   
5. Fabricação de micro-drives
   
   Cada unidade micro-consiste de um parafuso custom-usinado e um tubo de suporte oco (Fig. 2). O parafuso e tubo de apoio são ligados em conjunto de tal forma que um lábio no parafuso é incorporado em acrílico, deixando o parafuso para girar livremente (Fig. 2B). O parafuso é rosqueada na base de plástico, eo tubo de suporte é então conduzido para cima ou para baixo quando o parafuso é girado, avançar ou retrair o tetrode que ele carrega. Para maior facilidade de ajuste no animal se comportando, a cabeça do parafuso é na forma de um meio cilindro. Faça uma chave de fenda personalizado para este parafuso:
   
   1. Corte de 5 cm de 15 tubos de aço inoxidável Ga.
   2. Pegue um dos parafusos personalizados e moer fora do bordo saliente.
   3. Insira o parafuso no tubo até o topo do parafuso fique nivelada com a extremidade do tubo.
   4. Esmagar os tubos ao redor do roscas repetidamente com um par de alicates de travamento de modo que o parafuso não pode girar em relação à cânula.
   5. Use um torno do pino para segurar a chave de fenda personalizado.
      
      Para fabricar os discos micro-usamos um 3-D molde impresso de plástico com pequenos poços (3 mm x 5 mm, 2 mm de profundidade). Cada poço tem dois buracos na superfície inferior, com espaçamento de 2 mm, para o tubo de suporte eo parafuso. Alternativamente, os moldes podem ser fabricados a partir de um plástico de engenharia, como Delrin, usando uma furadeira para criar o bem e buracos.
   
   
   6. Prepare o molde, limpando o buraco para a cânula de suporte usando uma agulha de 23 Ga e batendo o buraco para o parafuso, conforme descrito para a base de plástico, acima.
   7. Linha dentro da bem com teflon lubrificante ou uma película fina de vaselina para permitir a liberação do acrílico dental curada do molde ..
   8. Aplique lubrificante teflon a um parafuso e insira-o molde usando a chave de fenda feitos até os fios estão logo abaixo do fundo do poço.
   9. Irritar a 2-3 mm topo de um tubo de suporte 14 milímetros de comprimento (23 Ga tubos de aço inoxidável) com um rebolo para melhorar a aderência do acrílico dental. Insira-o no molde até o topo da cânula é metade do caminho entre o topo do poço eo topo do parafuso.
   10. Despeje acrílica dental dentro do poço. Movimento de agitação é usado para garantir que o acrílico dental flui em todos os espaços ao redor do parafuso e tubo de suporte. Remover quaisquer bolhas de ar com uma pequena agulha.
   11. Aguarde até que o acrílico dental é completamente curado (15-30 minutos) e remova a unidade micro-do molde, girando o parafuso de contra-relógio sábio.
   12. É importante fazer um controlo de qualidade das unidades de micro-. Inspecionar o acrílico dental curada por rachaduras e / ou bolhas de ar, que geralmente são causados ​​por acrílico dental que era demasiado grossa ou muito fina. Além disso, certifique-se o parafuso e tubo de suporte são paralelas entre si e que o parafuso gira suavemente. Parafusos e tubos de suporte de micro-unidades que não cumpram estes critérios pode ser quebrada livre do acrílico dental e reciclados.
   13. Repita os passos 5,6 por 5,11 até que tenha 21 micro-drives.


6. Montagem final do micro-drive série
   
   
   1. Inferior cada unidade micro-unidade na base de plástico. Cada tubo de suporte micro-drive deve mover-se suavemente dentro de sua luva e sobre o seu tubo de guia estacionário. Certifique-se que os tubos guia não fiquem deformadas como a unidade de micro-está sendo reduzido.
   2. Com as unidades de micro-totalmente abaixada, adicionar uma camada fina de acrílico dental para o interior da base de unidade para corrigir os tubos guia eletrodo no lugar.
   3. Que na falta de mais baixa das unidades micro todo o caminho antes de adicionar o acrílico dental irá resultar em absorção do acrílico todo o caminho até as mangas e obstrução da unidade de micro movimento.
   4. Rotular o micro-drives 21/01.
   5. Vire a unidade matriz de cabeça para baixo e tirar uma foto do feixe de tubos de guia. Esta imagem será usada para mapear a localização do tubo guia correspondente a cada unidade de micro-.
   6. Levantar todas as unidades de micro-por vários milímetros.
   7. Inserir um tubo transportador poliimida (0,005 ") para cada tubo guia da parte inferior da base da unidade. Deixe o tubo transportador estender 1-2 mm do topo do registro totalmente abaixada e drive-micro e na fotografia a identidade do unidade de micro-correspondente.
   8. Cole astubo transportador para o tubo de suporte micro-drive usando 5 minutos epóxi ou cola de cianoacrilato. Note-se que a cola epóxi ou muito fino fluirá para baixo a cânula de apoio e obstruir o movimento livre da unidade micro-ou, pior, corrigi-lo para a cânula guia. Se isso acontecer, essa unidade micro-drive especial não pode ser usado.
   9. Abaixe totalmente todas as unidades de micro-. Cortar todos os tubos de descarga transportadora off na parte inferior da cânula coletor usando uma lâmina de barbear fresco.
   10. Finalmente, montar a placa de interface Neuralynx eletrodo à base da unidade utilizando dois parafusos (tamanho: 1-72, comprimento: 3 / 16 ").

Neste ponto, a unidade matriz está pronto para ser carregado com tetrodes. Fabricação de tetrodes, como colocá-las no micro-drives, e como preparar a matriz unidade para implantação cirúrgica são os temas de um artigo de vídeo subseqüentes.

Figura 1. Modelo de matriz micro drive-acabados. A unidade matriz micro-consiste de vários componentes principais: uma base de movimentação de plástico, um coletor de cânula que o tetrodes entrar no cérebro, 21 micro-unidades que cada unidade um tetrode único; uma placa de interface eletrodo que conecta a pré-amplificadores.

Figura 2. Personalizado disco micro-parafusos. A. desenhos técnicos do projeto parafuso personalizado. O parafuso possui uma parte roscada (M1.2x0.25; 1,2 mm de diâmetro, 0,25 mm / volta)., Uma cabeça semi-cilindro que corresponde a nossa chave de fenda feitos e uma parte lisa com lábio (ver detalhe) B. Modelo de unidade de micro-completa. O tubo de suporte e parafusos personalizados são ligados com cimento dental. O lábio no parafuso é incorporado no cimento dental e permite a rotação livre durante a condução do tubo de suporte para cima ou para baixo.

Arquivos adicionais

Nós projetamos a base da unidade impressa, o cone de proteção eo molde para a construção das unidades de micro-in SolidWorks 2008 software CAD 3D:

• Baixar o arquivo: DriveBase.sldprt que contém os modelos da base de unidade e cone de proteção e gorro.
• Baixar o arquivo: MicroDriveMold.sldprt que contém modelo do molde micro-drive

O bureau de serviços de impressão 3D não pode lidar com arquivos nativos Solidworks diretamente, mas sim requer os arquivos de desenho em CAD formato estereolitografia (STL). Para as pessoas que não têm acesso a software Solidworks, mas ainda gostaria de usar as peças impressos utilizados no artigo de vídeo que incluem os desenhos em formato STL também:

• Baixar o arquivo: DriveBase.stl que contém modelo de base de disco
• Baixar o arquivo: MicroDriveMold.stl que contém modelo de micro-drive de moldes
• Baixar o arquivo: ProtectionCap.stl que contém modelo de tampa para o cone de proteção
• Baixar o arquivo: ProtectionCone.stl que contém modelo de cone de proteção

Discussion

Este protocolo descreve as características gerais do processo de construção micro-drive. Foi com sucesso modificado para produzir matrizes de unidade com metas de gravação múltipla ou matrizes menores para gravações em camundongos. Além da gravação do hipocampo, muitos pesquisadores usam essas unidades para atingir estruturas corticais e sub-cortical. O uso de parafusos mais longos podem ser necessários, a fim de gravar a partir de estruturas mais profundas do cérebro. Com uma ampla modificação na base da unidade, unidades motorizadas meu ser usada no lugar dos entes que virou manualmente, permitindo que mais precisa, o ajuste tetrode remoto (Yamamoto e Wilson, 2008). Arranjos personalizados cânula guia estacionárias têm sido usados ​​no lugar da cânula circular principal para conseguir o controle sobre a distribuição espacial de tetrodes no córtex e hipocampo.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
3D-printed plastic parts	Material	American Precision Prototyping (www.approto.com)
stainless steel tubing	Material	Small Parts (www.smallparts.com)
Dental cement powder	Material	A-M Systems (www.a-msystems.com)	525000
Dental cement solvent	Material	A-M Systems	526000
Electrode interface board	Material	Neuralynx (www.neuralynx.com)	EIB-81
micro-drive screws	Material	Advanced Machining and Tooling (www.amtmfg.com)
’Tap-Ease’ tapping lubricant	Tool	AGS Company	TA-2
Polyimide tubing	Material	IWG High Performance Conductors (www.iwghpc.com)
Cordless drill/driver	Tool	DeWalt (www.dewalt.com)	DC750KA
Variable-Speed Rotary Tool Kit with Flex-Shaft	Tool	Dremel (www.dremel.com)	3956-02
Razor blades	Tool	VWR (www.vwr.com)	55411-050
Watch glass	Tool	VWR	66112-107
Tap for custom screws	Tool	Balax	01302
Taps	Tool	Small Parts	HSBT-0172, HSBT-0080
Pin vise	Tool	Vargus	3SHC1--I
Drill bits	Tool	Small Parts
Benchtop vise	Tool	Panavise	301
No.2 Dumont forceps	Tool	Stoelting (www.stoeltingco.com)	52100-27
5-minute epoxy	Tool	Allied Electronics (www.alliedelec.com)
Accu-Tek Carbofib Tip Tweezers	Tool	Aven (www.aveninc.com)	18768 (Pattern 304)
Micro Dissecting Scissors	Tool	Biomedical Research Instruments (www.biomedinstr.com)	25-1000
Xcelite 378M Pliers	Tool	Newark	96F8903
mini pin vise	Tool	MSC Industrial Supply (www.mscdirect.com)	00920314