We beschrijven hoe te meten in de buurt van membraan en de wereldwijde intracellulair calcium dynamiek in gekweekte astrocyten met behulp van totale interne reflectie en epifluorescentie microscopie.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Het meten van de buurt plasmamembraan en Global intracellulair calcium Dynamics in Astrocyten
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
De hersenen bevatten gliacellen. Astrocyten, een soort van gliale cel, zijn al lange tijd bekend dat een passieve ondersteunende rol te verstrekken aan neuronen. Echter, steeds meer bewijs suggereert dat astrocyten kunnen ook actief in de hersenfunctie deel te nemen door middel van functionele interactie met neuronen. Echter, veel fundamentele aspecten van de biologie astrocyte blijven controversieel, onduidelijk en / of experimenteel onontgonnen. Een belangrijk punt is de dynamiek van de intracellulaire calcium transiënten in astrocyten. Dit is relevant omdat calcium is goed ingeburgerd als een belangrijke tweede boodschapper en omdat is voorgesteld dat astrocyten calcium verhogingen kan de afgifte van zenders van astrocyten te activeren. Toch is er nog geen gedetailleerd of bevredigende beschrijving van de buurt plasmamembraan calcium signalisatie in astrocyten. Totale interne reflectie fluorescentie (TIRF) microscopie is een krachtig hulpmiddel om fysiologisch relevante signalering gebeurtenissen te analyseren binnen ongeveer 100 nm van het plasmamembraan van levende cellen. Hier gebruiken we TIRF microscopie en hoe dat monitor in de buurt plasmamembraan en de wereldwijde intracellulair calcium dynamiek vrijwel gelijktijdig. De verdere verfijning en systematische toepassing van deze aanpak heeft de potentie om te informeren over de precieze details van astrocyten calcium signalering. Een gedetailleerde kennis van astrocyten calcium dynamiek kan een basis bieden om te begrijpen of, hoe, wanneer en waarom astrocyten en neuronen ondergaan calcium-afhankelijke functionele interacties.
Protocol
Experimentele procedures
De experimentele procedure bestaat uit twee belangrijke onderdelen die hieronder worden beschreven in een stapsgewijze manier.
Deel 1: VOORBEREIDING hippocampus astrocyten CULTUREN
In het kort werden gemengd hippocampal astrocyten-neuron culturen bereid met behulp van een gevestigde protocol 1,2,3. We geoptimaliseerd de procedure om een gezonde gekweekte astrocyten opleveren. Alle procedures hieronder vermelde moet worden uitgevoerd in een steriele omgeving, zoals een laminaire stroming kap.
Voorbereiden coversl....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Het is goed vast te staan dat astrocyten intracellulair calcium verhogingen weer te geven. Deze zich voordoen spontaan, kan worden veroorzaakt door neuronale activiteit of door toepassing van agonisten aan receptoren activeren op de astrocyt oppervlak 11. Een belangrijke en controversiële kwestie is of de astrocyten intracellulair calcium hoogtes kan leiden tot het vrijkomen van signaalmoleculen die receptoren te activeren op neuronen 11, 12. Dit is controversieel omdat er bewijzen voor en tegen deze opvatting, zoals.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Dankbetuigingen
Dit werk werd ondersteund door de Uehara Memorial Foundation van Japan (tot ES), alsmede de Whitehall Stichting, het Nationaal Instituut voor Neurologische Aandoeningen en Stroke en een Stein-Oppenheimer Endowment Award (voor BSK).
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen | |
|---|---|---|---|---|
| VWR® Micro Dekglasjes, rond, nr. 1 | Instrument | VWR international | 48380-068 | |
| Poly-D-lysine hydrobromide | Reagens | Sigma-Aldrich | P0899 | |
| Laminine uit Engelbreth-Holm-Swarm muissarcoom basaalmembraan | Reagens | Sigma-Aldrich | L2020 | |
| Earle’s Balanced Salt Solution (EBSS) (1X), vloeibaar | Reagens | Invitrogen | 14155-063 | |
| Minimum Essential Medium (MEM) (1X), vloeibaar Bevat Earle’s zouten, maar geen L-glutamine of fenolrood | Reagens | Invitrogen | 51200-038 | |
| Penicilline-streptomycine vloeibaar | Reagens | Invitrogen | 15140-122 | |
| Natriumpyruvaatoplossing | Reagens | Sigma-Aldrich | S8636 | |
| HEPES-oplossing 1 M | Reagens | Sigma-Aldrich | H0887 | |
| N-2 Supplement (100X), vloeibaar | Reagens | Invitrogen | 17502-048 | |
| Paardenserum, hitte-geïnactiveerd | Reagens | Invitrogen | 26050-088 | |
| PAPAIN-022 | Reagens | Worthington Biochemical | LK003178 | |
| Neurobasal™ Medium (1X), vloeibaar zonder fenolrood | Reagens | Invitrogen | 12348-017 | |
| B-27 serumvrij supplement (50X), vloeibaar | Reagens | Invitrogen | 17504-044 | |
| L-glutamine-200 mM (100X), vloeibaar | Reagens | Invitrogen | 25030-149 | |
| Celzeven | Instrument | BD Biosciences | 352350 | |
| BD Falcon multiwell platen met platte bodem en deksels, steriel | Instrument | BD Biosciences | 353046 | |
| NaCl | Reagens | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| KCl | Reagens | Sigma-Aldrich | P3911 | |
| CaCl2 hexahydraat | Reagens | Sigma-Aldrich | 21108 | |
| MgCl2 hexahydraat | Reagens | Sigma-Aldrich | M2670 | |
| HEPES vrij zuur | Reagens | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| D-(+)-glucose | Reagens | Sigma-Aldrich | G7528 | |
| Fluo-4, AM 1 mM oplossing in DMSO | Reagens | Invitrogen | F-14217 | |
| Pluronic® F-127 20% oplossing in DMSO | Reagens | Invitrogen | P-3000MP | |
| Immersie-olie TYPE DF | Microscoop | Cargill Labs | 16242 | |
| Open kamer voor 25 mm ronde dekglasjes, 100 μl volume | Instrument | Warner Instruments | 64-0362 (RC-21BDW) | |
| P-2 platform voor Series 20 kamers, zonder verwarming | Instrument | Warner Instruments | 64-0278 (P-2) | |
| FluoSpheres carboxylaat-gemodificeerde microsferen, 0,1 μm, geel-groen fluorescent (505/515) 2% vaste stoffen | Reagens | Invitrogen | F8803 |
Referenties
- Richler, E., Chaumont, S., Shigetomi, E., Sagasti, A., Khakh, B. S. An approach to image activation of transmitter-gated P2X receptors in vitro and in vivo. Nature Methods. 5, 87-93 (2008).
- Granseth, B., Odermatt, B., Royle, S. J., Lagnado, L.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
