Summary
Noi descriviamo come misurare vicino a membrana e globale dinamiche di calcio intracellulare negli astrociti in coltura utilizzando riflessione interna totale e epifluorescenza.
Abstract
Il cervello contiene cellule gliali. Astrociti, un tipo di cellule gliali, sono da tempo noti per fornire un ruolo passivo di supporto ai neuroni. Tuttavia, una crescente evidenza suggerisce che gli astrociti possono anche partecipare attivamente nella funzione del cervello attraverso le interazioni funzionali con i neuroni. Tuttavia, molti aspetti fondamentali della biologia astrociti rimangono controversi, chiari e / o sperimentale inesplorati. Una questione importante è la dinamica dei transitori calcio intracellulare negli astrociti. Questo è importante perché il calcio è così affermato come un importante messaggero secondo e perché è stato proposto che elevazioni di calcio astrociti possono innescare il rilascio di trasmettitori da astrociti. Tuttavia, non vi è stata alcuna descrizione dettagliata e soddisfacente di calcio vicino a membrana plasmatica di segnalazione negli astrociti. Fluorescenza di riflessione interna totale (TIRF) microscopia è un potente strumento per analizzare gli eventi di segnalazione fisiologicamente rilevanti all'interno di circa 100 nm della membrana plasmatica delle cellule vive. Qui, usiamo microscopia TIRF e descrivono come monitor vicino membrana plasmatica e globale dinamiche di calcio intracellulare quasi simultaneamente. L'ulteriore perfezionamento e l'applicazione sistematica di questo approccio ha il potenziale per informare sui dettagli precisi della segnalazione calcio astrociti. Una comprensione dettagliata delle dinamiche di calcio astrociti possono fornire una base per capire se, come, quando e perché astrociti e neuroni subiscono interazioni funzionali calcio-dipendente.
Protocol
Procedure sperimentali
La procedura sperimentale consiste di due parti principali che sono descritti in maniera saggia passo sotto.
Parte 1: PREPARAZIONE CULTURE astrociti dell'ippocampo
In breve, misto astrociti-neuroni dell'ippocampo culture sono state preparate utilizzando un protocollo ben definito 1,2,3. Abbiamo ottimizzato il procedimento per produrre sano astrociti in coltura. Tutte le procedure di seguito elencati deve essere effettuata in un ambiente sterile come una cappa a flusso laminare.
Coprioggetto preparazione
- Coprioggetto 22 mm (VWR, 48380-068)
- Poli-D-lisina (PDL, Sigma P0899), aliquote (1 mg / ml)
- Laminina aliquote (20 mg / ml): aggiungere 49 ml di acqua sterile a 1 mg / ml soluzione laminina (Sigma L2020), fanno aliquote da 1,2 ml e conservare a -20 ° C
- Sciogliere PDL in acqua sterile (50 mg / ml)
- Autoclave i coprioggetti, sciacquare con acqua sterile e posto in PDL (20 ml per 100 lamelle). Lasciare a temperatura ambiente per una notte.
- Sostituire il PDL con acqua sterile (3 lavaggi estensiva). Poi asciugare i coprioggetti e conservare a 4 ° C.
- Il giorno prima della placcatura astrociti, coprioggetto posto individuale in un pozzo sterile su un 6-pozzetti (pozzetti a fondo piatto Piatti con coperchio, sterile da BD Bioscience). Mettere 400 ml di laminina su ogni coprioggetto e incubare una notte, in incubatrice per evitare l'evaporazione.
Dissezione
Dissezione dei media:
- 500 ml di Earle soluzione salina bilanciata (EBSS) (1X), liquido (Invitrogen, 14155-063)
- HEPES 5 ml di soluzione (Sigma, H0887)
Mezzi di comunicazione dell'ippocampo:
- 412,5 ml di media minima essenziale (MEM) (1X), liquido Contiene sali di Earle, ma non rosso L-glutammina o fenolo (Invitrogen, 51200-038)
- 10 ml di glucosio (Sigma, D-(+)-glucosio anidro SIGMA ULTRA G7528) 1 M a MEM
- 5 ml di penicillina-streptomicina (Invitrogen, 15140-122)
- 5 ml di soluzione di sodio piruvato (Sigma, S8636)
- 12,5 ml HEPES soluzione 1 M (Sigma, H0887)
- 5 ml N-2 Supplement (100X), liquido (Invitrogen, 17502-048)
- 50 ml di siero di cavallo, inattivato per calore (Invitrogen, 26050-088)
Papaina soluzione:
- Aggiungere 5 ml di dissezione dei media in Worthington papaina-022 flaconcino (LK003178; concentrazione finale, 20 U / ml) e incubare a 37 ° C per 60 min.
- Decapitare ratti di età compresa tra P1 (in genere 2 cuccioli) le linee guida controllati e approvati dalla normativa nazionale e Cura il tuo locale degli animali e del Comitato Istituzionale Usa.
- Togliere la pelle e il cranio e il cervello posto nella piastra di Petri riempite con i media dissezione a freddo.
- Rimosso meningi, sezionare entrambi gli emisferi e sezionare dell'ippocampo.
- Tritate la dell'ippocampo in ~ 1X1 pezzi mm e digerire in soluzione papaina a 37 ° C per 11-13 minuti.
- Una volta che i pezzi di tessuto sono insediati, rimuovere la papaina con cura e aggiungere 5 ml di terreno dell'ippocampo a rimuovere tutte le tracce di un enzima. Ripetere questo passaggio e risospendere in media dell'ippocampo (2 ml).
- Triturare le cellule ~ 5 volte fino a quando non ci sono grumi sinistra, con tre fiamma lucido pipette di fori progressivamente più piccoli (1000 micron, ~ 500 micron e ~ 300 micron).
- Una volta triturato, le cellule passano attraverso un filtro cella (dimensione dei pori, 70 micron, BD Bioscience). Contare le cellule in 10 ml di sospensione. Regolare il volume di terreno dell'ippocampo in modo da avere 400000 cellule / ml.
- Aspirare il laminina fuori i coprioggetti, e prima che le coperture possono asciutto, piatto 200 microlitri della sospensione cellulare per coprioggetto.
- Lasciateli per attaccare per 60 minuti in incubatrice, e poi aggiungere 2 ml di terreno dell'ippocampo per bene.
- Il giorno successivo, aspirare vecchi media dell'ippocampo per rimuovere le cellule morte e detriti e aggiungere 2 ml di pre-riscaldato terreno fresco dell'ippocampo.
Manutenzione
Mezzi di comunicazione Neurobasal:
- 500 ml neurobasal (Invitrogen, 12348-017)
- 10 ml di siero B27 supplemento gratuito (Invitrogen, 17504-044)
- 5 ml di penicillina-streptomicina (Invitrogen, 15140-122)
- 1,25 ml L-glutamina (Invitrogen, 25030-149)
Feed the culture astrociti-neuroni due volte alla settimana con il mezzo neurobasal, a partire da quattro giorni dopo la placcatura. Preincubare i media di circa 30 minuti in incubatrice in un pallone ventilato per equilibrare la temperatura e CO 2.
Parte 2: IMAGING DI CALCIO
Registrazione dell'ippocampo tampone: 110 mM NaCl, 5.4 mMKCl, 1,8 mM CaCl 2, 0,8 mM MgCl 2, 10 mM D-glucosio, 10 mM HEPES (Tutti i prodotti chimici da Sigma), pH 7.4 (corretto con NaOH).
Caricamento indicatore colorante calcio in astrociti
- Posizionare la cultura in un bene su un 6-pozzetti riempiti con 2 ml di buffer di registrazione dell'ippocampo contenente 2,5 mM Fluo-4, AM (Invitrogen, F-14217) e 0,05% Pluronic soluzione ® F-127, il 20% in DMSO (Invitrogen, P-3000MP) e incubare a temperatura ambiente per 10-30 min.
- Rimuovere Fluo-4 soluzione e lavare coprioggetto 3 volte con buffer di registrazione dell'ippocampo e incubare a temperatura ambiente per 30 min.
- Posizionare il coprioggetto sulla camera, e pulire il lato del vetrino con il liquido per pulire le lenti.
- Metti una piccola goccia di olio da immersione (olio DF immersione TIPO da Cargille) l'obiettivo e mettere da camera (camera aperta per 25 coprioggetto tondo mm dalla Warner Instruments) sul palco del microscopio (Olympus IX71).
- Guarda le cellule usando la luce di trasmissione per vedere come le cellule aspetto, e portarli a fuoco. Poi illuminare le cellule con 488 nm da un monocromatore (policroma V da TILL Vision) e determinare se il segnale di fluorescenza di Fluo-4 è uniforme e rilevabile negli astrociti.
- Usa EPI e TIRF illuminazione per misurare il calcio negli astrociti.
Microscopia TIRF
In breve, usiamo un microscopio Olympus IX71 dotato di una fotocamera IXON Andor DV887DCS EMCCD. Il controllo di eccitazione e di acquisizione delle immagini è ottenuta utilizzando un software TILLVision. Le travi di 454/488/515 nm Argon (100 mW) e 442 nm allo stato solido (45 mW) i laser sono combinati e controllati con una FINO Polilinea laser combinatore, TIRF porta a condensatore a doppio e acoustoptical filtro sintonizzabile e controller (AOTF; tutto da FINO Photonics) e inseriti in una fibra Kineflex a banda larga per l'ingresso nel condensatore TIRF. Usiamo un Olympus 60X 1,45 lente NA per raggiungere TIRF. Il guadagno della telecamera è adeguato, per ogni astrociti per fornire il miglior segnale al rumore delle immagini. Lo sfondo ed i principi della microscopia TIRF sono state recentemente recensione 4, 5. La maggior parte dei componenti ottici che utilizziamo sono stati acquistati da TILL Photonics, che ora fa parte di Agilent Technologies (http://www.till-photonics.com/). La profondità di penetrazione TIR può essere calcolato dalle equazioni di seguito.
d = profondità di penetrazione
n1 = indice di rifrazione del vetro
n2 = indice di rifrazione di cellule
un angolo di incidenza =
NAi = apertura numerica di incidenza
Al fine di garantire il laser è allineato in modo ottimale per TIRF riteniamo utile osservare 100 nm perline fluorescenti (Invitrogen, F8803). Vi presentiamo fotogrammi e video di perline con EPI e microscopia TIRF. Quando nel TIRF, si osserva un aumento drammatico nel rapporto segnale-rumore e le perline visualizzazione diffusione browniano. Per noi è utile osservare il comportamento di 100 nm con perline microscopia TIRF su base regolare (~ una volta a settimana) per essere sicuri che TIRF ottimale si verifica, piuttosto che l'illuminazione compromessa obliqua che si verificherebbe se l'angolo critici non sono stati pari a α (vedi Fig. 1).
Applicazione di agonisti accoppiata G-proteina recettore
Astrociti esprimono una varietà di Gq recettori accoppiati 6, 7 tra cui i recettori metabotropici del glutammato e recettori P2Y (agonista, ATP, ADP). L'attivazione di questi recettori porta ad un aumento significativo dei livelli intracellulari di calcio in astrociti. Per esempio, si può facilmente osservare prospetti del calcio intracellulare durante l'applicazione di ATP (30 mM) a 8-10 astrociti. Usiamo una soluzione rapida switcher da Warner Instruments chiamato VC-77SP Fast-Passo del sistema di perfusione (http://www.warneronline.com/index.cfm). Con questo metodo le soluzioni possono essere applicate in meno di ~ 10 ms.
Cartoon FIGURA 1. Fotografie e immagini del set up. A. mostra una fotografia del microscopio montato su un airtable, mentre (B) mostra una fotografia del gruppo laser, controllori e scatole fascio. C. Mostra una fotografia della scena microscopio con la camera montata per l'imaging. A sinistra il dispositivo di perfusione veloce può essere visto (insieme con il motore passo-passo e tubi theta). Sulla destra il headstage di un amplificatore Axopatch 200A è visto. Il fumetto schematizza il percorso della luce nel set up e come TIRF è raggiunto. Il laser viene focalizzato sul piano focale posteriore della lente dell'obiettivo 60X 1,45 NA e la sua posizione viene regolata fuori centro in modo che emerge in olio da immersione al α angolo critico. A questo punto il fascio soffre di riflessione interna totale e decade con una distanza λ (vedi equazione nel testo principale) nel mezzo di indice di rifrazione più basso. In questo caso, questo è il buffer di registrazione che circonda la astrociti e gli astrociti stessi. Il risultato è eccitazione ottica (e quindi immagini) di molecole all'interno di ~ 100 nm della membrana plasmatica. Nel cartone animato della cellula, viene visualizzato come verde "eccitato" recettori di membrana, mentre quelli all'interno della cellula o sulla superficie superiore della cella non sono entusiasti. Un resoconto completo di microscopia TIRF è stata fornita da Steyer e Almers 4.
FIGURA 2. Immagini di 100 nm perline fluorescenti acquisito con EPI e microscopia TIRF. A. mostra le immagini EPI di un campo di vista con diverse decine di 100 nm perline fluorescenti. Il punto rosso frecce per perline che si sono insediati sul vetrino di vetro, mentre le frecce blu indicano che sono perle di diffusione in acqua. B. mostra un'immagine TIRF dello stesso campo di vista, come mostrato in A. In questa visione solo le perle aderente mostrato dalle frecce rosse sono visibili. Questo perché questi si erano stabiliti sulla coverlsip vetro e sono stati pertanto nel campo 100 nm ~ evanescente. Le perle mostrato in A con frecce blu non sono in questa regione e sono quindi invisibili nelle immagini TIRF. I grafici mostrano inferiore rendering 3D delle immagini. E 'chiaro che un forte aumento del rapporto segnale-rumore si verifica per perline all'interno del campo evanescente quando osservate al microscopio TIRF. Infatti per queste immagini il rapporto segnale-rumore per EPI è stato 7,1 ± 0,6, mentre per TIRF era 20 ± 0,7.
FIGURA 3. Immagini di astrociti caricato con Fluo-4 colorante indicatore di calcio acquisito con EPI e microscopia TIRF. A. EPI immagini di un campo di vista con cinque astrociti. B. Una immagine TIRF dello stesso campo di vista mostrato in B. Nota che le immagini in A e B sono significativamente differenti. Questo perché con TIRF illuminazione solo le regioni membrana plasmatica in apposizione vicino al coprioggetto di vetro sono ripreso. I pannelli inferiori mostrano ATP-evocate transienti di calcio intracellulare ripreso con EPI e microscopia TIRF.
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Discussion
E 'ben dimostrato che gli astrociti visualizzare prospetti del calcio intracellulare. Questi si verificano spontaneamente, può essere attivato da un'attività neuronale o mediante l'applicazione di agonisti per attivare i recettori sulla superficie astrociti 11. Un tema importante e controverso è se astrociti prospetti del calcio intracellulare può innescare il rilascio di molecole di segnalazione che attivano i recettori sui neuroni 11, 12. Questo è controversa perché c'è stata la prova a favore e contro questa visione, come evidenziato nella revisione da parte Haydon 7, 13 e 11 laboratori di McCarthy. Sulla base delle nostre immagini recenti fetta del cervello e dei dati di elettrofisiologia abbiamo sostenuto che una migliore comprensione delle dinamiche e preciso calcio astrociti è necessario prima di esperimenti guidati nuova ipotesi può essere progettato per determinare in che modo i neuroni impatto astrociti 14. In questo articolo vi presentiamo il video di un metodo semplice per l'immagine vicino membrana plasmatica e cambiamenti globali calcio intracellulare quasi contemporaneamente negli astrociti in coltura. Un requisito imprescindibile tecniche di microscopia TIRF è che le cellule in coltura devono essere usati perché aderire ad un coprioggetto di vetro all'interno della profondità di campo evanescente 3. Vale la pena notare che gli astrociti nella cultura modificare i propri profili di espressione genica rispetto a quelli in vivo 15, e quindi questo avvertimento deve essere considerato in sede di attuazione di questo metodo. Con questa considerazione in mente però il metodo semplice riportiamo si permettono di immagine e quantificare vicino membrana plasmatica e cambiamenti globali calcio intracellulare quasi simultaneamente. L'ulteriore applicazione del metodo di astrociti mantiene la promessa di fornire dati precisi sulle variazioni intracellulari di calcio in prossimità della membrana plasmatica di astrociti. La disponibilità di tali dati quantitativi saranno utili per la completa comprensione della biologia degli astrociti.
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Acknowledgments
Questo lavoro è stato sostenuto dalla Fondazione Memorial Uehara del Giappone (ES) e la Fondazione Whitehall, del National Institute of Neurological Disorder and Stroke e un Stein-Oppenheimer Premio Endowment (a BSK).
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| VWR® Micro Cover Slips, Round, No. 1 | Tool | VWR international | 48380-068 | |
| Poly-D-lysine hydrobromide | Reagent | Sigma-Aldrich | P0899 | |
| Laminin from Engelbreth-Holm-Swarm murine sarcoma basement membrane | Reagent | Sigma-Aldrich | L2020 | |
| Earle’s Balanced Salt Solution (EBSS) (1X), liquid | Reagent | Invitrogen | 14155-063 | |
| Minimum Essential Medium (MEM) (1X), liquid Contains Earle’s salts, but no L-glutamine or phenol red | Reagent | Invitrogen | 51200-038 | |
| Penicillin-Streptomycin liquid | Reagent | Invitrogen | 15140-122 | |
| Sodium pyruvate solution | Reagent | Sigma-Aldrich | S8636 | |
| HEPES solution 1 M | Reagent | Sigma-Aldrich | H0887 | |
| N-2 Supplement (100X), liquid | Reagent | Invitrogen | 17502-048 | |
| Horse Serum, Heat-Inactivated | Reagent | Invitrogen | 26050-088 | |
| PAPAIN-022 | Reagent | Worthington Biochemical | LK003178 | |
| Neurobasal™ Medium (1X) Liquid without Phenol Red | Reagent | Invitrogen | 12348-017 | |
| B-27 Serum-Free Supplement (50X), liquid | Reagent | Invitrogen | 17504-044 | |
| L-Glutamine-200 mM (100X), liquid | Reagent | Invitrogen | 25030-149 | |
| Cell Strainers | Tool | BD Biosciences | 352350 | |
| BD Falcon Multiwell Flat-Bottom Plates with Lids, Sterile | Tool | BD Biosciences | 353046 | |
| NaCl | Reagent | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| KCl | Reagent | Sigma-Aldrich | P3911 | |
| CaCl2 hexahydrate | Reagent | Sigma-Aldrich | 21108 | |
| MgCl2 hexahydrate | Reagent | Sigma-Aldrich | M2670 | |
| HEPES free acid | Reagent | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| D-(+)-glucose | Reagent | Sigma-Aldrich | G7528 | |
| Fluo-4, AM 1 mM solution in DMSO | Reagent | Invitrogen | F-14217 | |
| Pluronic® F-127 20% solution in DMSO | Reagent | Invitrogen | P-3000MP | |
| Immersion Oil TYPE DF | Microscope | Cargill Labs | 16242 | |
| Open chamber for 25 mm round coverslips, 100 μl volume | Tool | Warner Instruments | 64-0362 (RC-21BDW) | |
| P-2 platform for Series 20 chambers, non-heater | Tool | Warner Instruments | 64-0278 (P-2) | |
| FluoSpheres carboxylate-modified microspheres, 0.1 μm, yellow-green fluorescent (505/515) 2% solids | Reagent | Invitrogen | F8803 |
References
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