Summary
Hier beschrijven we een protocol om de migratie van gliacellen te onderzoeken in de zich ontwikkelende Drosophila oog met behulp van levende microscopische analyse gecombineerd met GFP gelabelde gliacellen.
Abstract
Gliale cellen van zowel gewervelde en ongewervelde organismen moeten migreren naar uiteindelijke doelstelling regio's om te ensheath en te ondersteunen verbonden neuronen. Terwijl de recente vooruitgang is geboekt om de live-migratie van gliacellen te beschrijven in de ontwikkelingslanden popstadium vleugel (1), studies van
Protocol
Deel 1: Pre-experimentele set-up.
- Een week op voorhand, mate vliegt genereren larve die uitdrukken GFP onder de controle van een glia-specifieke promoter. Voor ons experiment hebben we gevisualiseerd GFP getagd met een nucleair lokalisatie volgorde uitgedrukt in gliale cellen met behulp van de omgekeerde polariteit (repo) promotor (3, 4).
- Bereid dekglaasjes ten minste een dag van tevoren door het weken 18 mm ronde dekglaasjes gedurende 10 minuten in 1% poly-L-lysine oplossing en de lucht drogen 's nachts.
- Op de dag voor het experiment, schoon een Chamlide magnetische cultuur kamer door het weken componenten 's nachts in 70% ethanol.
- Op de dag van het experiment, voor te bereiden kweekmedium door het toevoegen van foetaal runderserum, penicilline-streptomycine-oplossing, en insuline tot 10 ml insect medium Schneiders met behulp van aseptische technieken. De werkende concentraties zijn: 1X foetaal runderserum, 100U/ml penicilline, streptomycine 0.1mg/ml en 0,2 mg / ml insuline in insectencellen medium Schneider (gemodificeerd van (5)).
- Laat de cultuur kamer te droge lucht in een celcultuur kap. Afwassen resterende ethanol uit de cultuur kamer door spoelen met voorbereide kweekmedium.
Deel 2: Dissectie van de Drosophila eye-brain complex.
- Selecteer een derde instar dwalen larve van de zijde van een vlieg flacon en plaats in een daling van gekoelde kweekmedium op een petrischaaltje op ijs gedurende enkele minuten. Chilling de larve wordt aanbevolen om peristaltische contracties lichaam langzaam voor het gemak van dissectie.
- Plaats de gekoelde larve in een daling van kweekmedium op een Sylgard gecoate schaal onder een dissectie microscoop.
- Onder de dissectie microscoop, het gebruik van een paar Dumont fijne tang stevig vastpakken van de larve ongeveer een derde van de weg van de achterste einde. Wacht tot de larve extrudeert zijn mond haken vanaf het voorste eind. Pak de mond haken met een tweede pincet bij volledige extensie. Te ontleden de larve, langzaam trekt de twee paren van de tang in tegengestelde richting. Het oog-brein-complex, samen met de speekselklieren, vet lichamen en verbeelding weefsel, weg zal trekken uit het larvale lichaam. Trek niet aan de mond haken te snel anders zullen ze af scheuren van het oog-hersen-complex.
- Trim weg speekselklieren, vet lichamen en verbeelding schijven met behulp van ultra-fijne klipper schaar. De twee hemisferen van de hersenen en oog-discs zullen worden toegevoegd aan de ventrale zenuw snoer en de mond haken.
- Plaats een 18 mm dekglas op een glasplaatje. Laat een rand van het dekglas opknoping over de rand van de dia om later halen de dekglas. Voeg een druppel kweekmedium op de 18 mm dekglas. Breng de oog-brein-complex in het kweekmedium door vast te pakken de mond te haken met een tang. Niet direct begrijpen het oog-hersen-complex met de tang of het weefsel wordt beschadigd.
- Met behulp van fijne dissectie schaar, knip uit de mond haken uit het oog-hersenen complex en gooi deze weg. Het verwijderen van de mond haken is belangrijk voor de live-imaging als de mond haken zal blijven contract in het kweekmedium waardoor het weefsel te bewegen tijdens de microscopie.
- Om gliale migratie te visualiseren in het oog verbeelding schijf, knip voorzichtig de optische steel, de dunne weefsel dat de hersenen en de ogen schijf verbindt en weg te duwen of verwijderen van de hersenen (zie figuur 1A). Te visualiseren glia binnen de optische steel, laat de hersenen, optische stalken, en in het oog verbeelding schijf intact (zie figuur 1E).
- Pak de dekglaasje met behulp van pincet en trek een cirkel rond onder het weefsel van belang met een permanent marker. Deze cirkel zal helpen bij het lokaliseren van de weefsel voor microscopie in deel 4.
Deel 3: Montage van de ogen denkbeeldige schijf in een magnetisch cultuur kamer.
- Met behulp van een tang, pakt u de opknoping rand van het dekglaasje. Breng de dekglaasje op de bodemplaat van de Chamlide magnetische kamer zonder verstoring van het weefsel in cultuur.
- Plaats de siliconen O-ring op het hoofdgedeelte van de Chamlide kamer. Installeer het belangrijkste orgaan op de top van de bodemplaat.
- Voeg langzaam kweekmedium naar de kamer. Niet toe te voegen het kweekmedium te snel of het weefsel van de rente zal worden verstoord. Niet volledig vullen de kamer om voor gasuitwisseling mogelijk maken onder de kap.
- Plaats voorzichtig de onzichtbare deksel op de top van de Chamlide kamer.
Deel 4: Visualisatie van migrerende gliacellen in het oog disc.
- Plaats de cultuur kamer op het podium van een confocale of fluorescentie microscoop. Zoek het monster met behulp van de cirkel op de dekglaasje als een referentie op lage vergroting.
- Focus op het monster met behulp van een 40x lens. Laat het weefsel om zich te vestigen op het dekglaasje. Maak foto's van het oog schijf of optische stalken elke 10-15min gedurende 3-4 uur. Het weefsel kan trillen en bewegen onscherp. Handmatig scherpstellen het weefsel voordat de foto zal verlichten eis probleem.
Deel 5: Representatieve resultaten:
Correct wordt uitgevoerd, ons protocol liet ons toe om een reeks beelden van GFP-gelabelde gliacellen die van de optische steel migreerden in het oog denkbeeldige schijf (figuur 1 BD) te verzamelen. Terwijl live beeldvorming voor een periode van 60 minuten was voldoende om veranderingen in de positie van gliale kernen binnen een wild-type oog verbeelding disc, observeren gliale kernen in een mutant van een gen dat nodig is voor gliale cel migratie geheel niet aan de optische steel (pijlen af te sluiten Figuur 1 FH).
We hebben gekweekt eye-hersen-complexen voor periodes zo lang als 240 minuten voor het observeren van verslechtering van de gekweekte weefsel. Na de 240-minuten time-punt dat we beginnen te GFP positieve cellen te observeren in het kweekmedium omliggende gekweekte oog-brein-complexen (pijl Figuur 2 C). Daarnaast GFP zal ophopen in diffuse plekken in de weefsels wijzen op een defect in het weefsel integriteit.
Figuur 1: Live beeldvorming van GFP-gelabelde gliale kernen in de ontwikkelingslanden wild-type en mutant visuele systemen.
A, E) Afbeeldingen gemaakt met behulp van differentieel interferentie contrast (DIC) microscopie van gekweekte wild-type en mutant eye-verbeelding schijven (ED). In het wild type, zijn gliacellen geboren in en migreren van de optische steel (OS) in het oog-disc. De hersenen is verwijderd om vervlakking en beeldvorming van het oog imaginaire disc te vergemakkelijken. BD) Fluorescentie microscopie van het wild type gekweekte oog verbeelding schijf in (A) op 0, 30, en 60 minuten de tijd punten onthult GFP-gelabelde gliale kernen migreren in het oog disc.
FH) Fluorescentie microscopie van de mutant eye-hersen-complex in (E) op 0, 30, en 60 minuten tijdstippen toont een blokkering van GFP-gelabelde gliale kernen binnen de optische steel (pijl). De hersenen (BR) is overgelaten aan de optische steel om beeldvorming van glia te vergemakkelijken in de steel.
Figuur 2: Live beeldvorming van GFP-gelabelde gliale membranen in een wild-type oog imaginaire disc. We hebben met succes gekweekt eye-hersen-complexen voor de 240-minuten periodes. Weefsel gekweekte langer dan 240 minuten begint af te breken. Het kweekmedium rondom het oog denkbeeldige disc (ED), optische steel (OS), en de hersenen kwab (BR) bij 0 (A) en 150 minuten (B), in vergelijking met de 300 minuten tijd-punt (C), is gratis van GFP-positieve cellen, aangegeven door een pijl.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
In dit protocol beschrijven we de observatie van gliale cel migratie in het oog denkbeeldige schijf met behulp van live-microscopie. In ons wild-type voorbeeld (figuur 1 AD), gebruikten we een nucleaire GFP marker om gliale cel beweging waarnemen in het oog disc in de loop van een uur. In een mutant voor een kandidaat-gen die nodig zijn voor gliale cel migratie momenteel onderzoek in ons laboratorium, zagen we een blokkering van gliale celkernen binnen de optische steel gedurende een periode van een uur (figuur 1 EH). Onze strategie kan worden aangepast om verdere details van cellulaire gedrag gereguleerd door onze gen van belang te visualiseren. Bijvoorbeeld, een membraan gerichte GFP molecuul, zoals mCD8-GFP, kan worden uitgedrukt in glia om cellulaire processen te visualiseren. Het gebruik van een membraan-gebonden GFP-marker zal ons toelaten om te bepalen of gliale cellen in ons mutanten in staat zijn van de uitbreiding van cellulaire processen zoals filopodia in het oog disc. Zo ook actine getagd met GFP of tubuline getagd met GFP kan worden uitgedrukt in de ontwikkelingslanden glia om veranderingen in het cytoskelet tijdens de gliale cel migratie te visualiseren. Daarnaast kan het onderzoek van een GFP-gemerkte mutant gliacellen worden gevisualiseerd met behulp van live microscopie (6). Deze techniek zal ons toelaten om de eis voor onze gen van belang nauwkeuriger te beschrijven in het reguleren van de migratie van gliacellen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Patrick Cafferty wordt ondersteund door een postdoctoraal fellowship van de Multiple Sclerose Vereniging van Canada.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Poly-L-lysine | Reagent | Sigma-Aldrich | P8920 | |
| Schneider’s Insect Media | Reagent | Sigma-Aldrich | S0146 | |
| Penicillin-Streptomycin | Reagent | Sigma-Aldrich | P4458 | |
| Insulin solution from bovine pancreas | Reagent | Sigma-Aldrich | I0516 | |
| Chamlide Magnetic chamber | Tool | Live cell Instrument | CM-R-10 | 35 mm dish type chamber for 18 mm coverslip |
| Ultra fine clipper scissors | Tool | Fine Science Tools | 15200-00 | |
| Dumont #5 forceps | Tool | Fine Science Tools | 11251-20 | |
| Fluorescent microscope | Microscope | Carl Zeiss, Inc. | Any fluorescent imaging system that has the necessary filters and excitation for GFP can be used. |
References
- Aigouy, B., Lepelletier, L., Giangrande, A. Glial chain migration requires pioneer cells. J. Neurosci. 28, 11635-11641 (2008).
- Silies, M., Yuva, Y., Engelen, D., Aho, A., Stork, T., Klambt, C. Glial cell migration in the eye disc. J. Neurosci. 27, 13130-13139 (2007).
- Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118, 401-415 (1993).
- Sepp, K. J., Auld, V. J. Conversion of lacZ enhancer trap lines to GAL4 lines using targeted transposition in Drosophila melanogaster. Genetics. 151, 1093-1101 (1999).
- Gibson, M. C., Patel, A. B., Nagpal, R., Perrimon, N. The emergence of geometric order in proliferating metazoan epitheia. Nature. 442, 1038-1041 (2006).
- Lee, T., Luo, L. Mosaic analysis with a repressible cell marker (MARCM) for Drosophila neural development. Trends Neurosci. 24, 251-254 (2001).
