Summary
Vi beskriver den fina dissekering av stomatogastric nervsystemet från magen av den amerikanska hummern (
Abstract
Med målet att förstå hur nervsystemet producerar verksamheten och svara på miljön, neuroforskare tur att modellera system som uppvisar aktivitet av intresse och är tillgängliga och öppna för experimentella metoder. Det stomatogastric nervsystemet (STNS) av den amerikanska hummern (
Protocol
Innan du påbörjar detta protokoll i magen av hummer måste avlägsnas från djuret och bereds enligt anvisningarna i sällskap JUPITER artikeln (Bierman & Tobin, 2009). Majoriteten av de steg som beskrivs nedan ska utföras under en dissektion mikroskop.
Del I-Isolera commissural Ganglia
- Rikta in parabol så att den främre änden (av LIP) är borta från dig och den bakre änden (från pylorus) är mot dig.
- Se till att magen är låst så att den ligger så plant som möjligt på skålen.
- Pin ner i matstrupen på varje sida av läppen.
- Om det behövs, ordna de andra stiften placerats under brutto dissekering.
- Ta bort underhuden.
- Ta tag i underhuden nära gm2/gm3 musklerna, ta loss den från dessa muskler och dra försiktigt i den främre riktning.
- Separera underhuden från den underliggande fett genom snipping några anslutningar. Använd ökad vård runt den centrala artären, som omsluter en viktig del av stomatogastric nervsystemet. Lämna underhuden intakt inom ungefär en 0,5 cm radie från stomatogastric ganglion, som sitter mellan gm1b muskler.
- Skär av separerade underhuden.
- Lossa hjärnan från den underliggande vävnaden.
- Identifiera de två stora commissural nerver som projektet bilateralt från den främre delen av hjärnan till commissural ganglierna i den främre delen av magen.
- Att lämna dessa nerver intakt, lyft försiktigt hjärnan med pincett och skär för att separera hjärnan från resten av vävnaden. Var försiktig när du gör detta, eftersom stomatogastric nerven under hjärnan och måste hållas intakt.
- Separera commissural ganglierna från omgivande vävnaden.
- Följ en av commissural nerver till en av de commissural ganglierna.
- Identifiera jon och son - dessa nerver måste förbli intakt. Den commissural ganglion kommer att ha många nerver som strålar ut. Skär de flesta av dem (utom jon och son), men lämna en extra nerv bifogas hålla commissural ganglion på plats när du är klar med dissektion.
- Upprepa med den andra commissural ganglion.
- Rengör jon och sonen i sidled till medialt. Lämna labiala nerven intakt för att förankra nervsystemet till magen. Esofagus ganglion sitter var jon s korsar varandra. Du kan rensa under den genom att ta tag i sämre ventrikulära nerv och dra upp att skära under.
Del II-Isolera Stomatogastric Ganglion (STG) och kvarvarande nerver.
- Separera STG från omgivande vävnaden.
- Den STG sitter inuti en artär som går mellan gm1b muskler och ner till gm2a, B muskler. Leta efter avskurna ändan av artär nära gm2a, B muskler.
- Dra den avskurna ändan av artären upp och anteriorly, avslöja DVN. Fortsätt att dra tills du når nivån för den återstående underhuden. När separerade, kan artären trimmas till den nivå där den vidrör återstående underhuden.
- Skär av muskeln flik som var belägen i talarstolen av hummer.
- Lyft upp underhuden över artären och konstaterade att artären gör en tunnel inne i fettet ovanför STG. Lägg ett blad av din sax inne i artär och skär i muskeln ovanför. Kontrollera att du kan se DVN när du klipper att vara säker på att du säkert över STG. Fortsätt skära anteriorly efter artären. Som du klippa ovanför STG, kommer du att kunna se STN härrör anteriorly från STG och dykning ner i muskeln. Fortsätt skära anteriorly att helt separera muskeln ovanför STG.
- Rensa alla vävnader från STN.
- Separera AGN s från den omgivande vävnaden. (Även om du inte planerar att spela in från AGN behöver du en del av intakt nerv till stift ner ganglion för intracellulära inspelningar.)
- För att bättre se AGN s tar du bort kvarvarande underhuden och ett tunt lager av den underliggande muskeln.
- Bara posteriort om STG, identifiera en mörk tunnel i fett och muskler på båda sidor av DVN.
- Stick en sax kniv inne i tunneln och skär vävnaden ovanför nerven. Fortsätt att skära i sidled efter nerv, att isolera den. (Ett par millimeter är tillräckligt för fastlåsning av ganglion, men utsätter minst 5 mm från AGN om du planerar att spela in från den.)
- Lossa AGN från muskeln den innerverar genom att skära av anslutningar.
- Upprepa på andra sidan för att isolera den andra AGN.
- När båda AGN s har dissekeras, skär alla muskler och vävnad som förbinder STG till magen.
- Isolera mvn S. De är ett bilateralt par små nerver förgrenar från LVN och korsa sidled under fett.
- Antingen använda sax eller två pincett för att skära igenom fett på ena sidan av DVN, nära där den förgrenar sig i två LVN S. Här är du långt från mvn s och kommer inte riskerar att skära dem.
- Lyft upp fettlager, och identifiera de små mvn under. Dessa nerver löper medialt till lateralt strax posteriort om nivån på gm1b muskler.
- Ta bort fettlager över mvn, lämnar nerven intakt för nu så att den inte trasslar ihop sig. Du kommer att sänka sin laterala slut från av magen i slutet av dissektion.
- Upprepa processen på andra sidan för att isolera den andra mvn.
- Isolera LVN s och bakre nerver.
- Starta där LVN kontorsrörelse i sidled från DVN, följa en LVN genom att skära fettet ovanför. Beroende på förberedelserna, ibland hela fettlagret ovanför nerven kan dras av.
- Fortsätt avslöjar LVN tills den punkt där PSN grenar av.
- Isolera pyn.
- Leta reda på pyn, det är en nerv som reser posteriort över pylorus.
- Ta bort det tunna membranet som täcker den här regionen.
- Isolera pyn genom att skära en liten del av pylorus, bifogas pyn.
- Lyft försiktigt pyloric avsnitt och skära bort vävnad på vardera sidan av pyn tills du kommer till gren som fäster vid PDN.
- Isolera PDN.
- Leta upp PDN, det är en nerv som reser posteriort till pyloric dilator muskeln.
- Skär en liten del av pyloric dilator muskeln, knuten till PDN.
- Lyft försiktigt pyloric avsnittet dilator muskler, skära bort vävnad på vardera sidan av PDN tills du kommer till gren som fäster vid pyn.
- Isolera den ventrala LVN, som ansluter pyn och PDN till LVN.
- Vid den trekantiga grenen punkt där pyn och PDN ansluta till ventrala LVN, isolera någon liten del av nerv som grenar av den ventrala LVN, såsom vpln. Detta kommer att användas som ett handtag att dra på den ventrala LVN.
- Lyft på handtaget och skära bort vävnad på vardera sidan av den ventrala LVN, som arbetar i den främre riktning tills du når den punkt där PSN grenar av.
- Upprepa steg 10 - 13 till isolera LVN och bakre nerver på andra sidan.
- Lossa stomatogastric nervsystemet från magen.
- För att till fullo ta bort LVN från magen, dra på PSN och skär alla vävnad och nerver bifogas LVN och ventrala LVN, med undantag för PDN och pyn. Upprepa denna process på andra sidan.
- Skär i sidled slutet av varje mvn. Lyft i sidled slutet och skär alla främmande bifogade filer mellan nerv och den underliggande magen vävnad.
- I framändan, klippa alla främmande bilagor till commissural ganglierna och skär labial nerven på varje sida.
- Visuellt skanna stomatogastric nervsystemet för att identifiera och sedan klippa ytterligare bilagor till magen vävnad.
- Ta ut den främre änden av båda commissural nerver, ovanför commissural ganglierna, och skala stomatogastric nervsystemet från magen och flytta den till sidan av skålen. När du gör det, skär eventuellt kvarvarande bilagor till fri nervsystemet.
- Förbered små Sylgard skålen.
- Gnid lite mage vävnad noga på ytan av Sylgard i den lilla skålen. Detta kommer att minska hydrofobicitet Sylgard, så att salt kommer att distribuera jämnt över skålen.
- Skölj och fyll Sylgard skålen med kyld koksaltlösning.
- Överför nervsystemet den färdiga Sylgard skålen genom att ta tag i främre änden av båda commissural nerver, lyfta nervsystemet ur stora fat, och om det i den lilla skålen.
- Nåla fast STNS i den lilla skålen med en kombination av minuten stift och tunnare stiften klippt från volfram tråd.
- Se till att preparatet ryggsidan upp genom att kontrollera att de underlägsna ventrikulära nerven pekar bort från Sylgard.
- Ta bort hjärnan och stift commissural nerverna.
- Dra försiktigt ut nervsystemet stram och plan genom att dra varje PSN s posteriort och sidled, och sätter ner dem.
- Ta bort pyloric dilator muskler från den PDN S och nåla PDN S.
- Ta bortpyloric segment från pyn S och stift den pyn S.
- Pin ner eventuella återstående isolerade nerver som labial nerver, mvn s och AGN S.
- Desheath på STG.
- Se till att STG är platt mot Sylgard och hållas sträckt med laterala AGN s, främre STN och den bakre DVN.
- Ordna belysning för att visualisering av axoner i DVN.
- Använd en liten nål eller fina volfram nål, gör ett litet grunt hål i höljet som omger DVN, bara posteriort om STG.
- Dra ut nålen över DVN, rygg till axoner, för att skapa en horisontell reva i nerv slida.
- Ta tag i luckan av nerv slida posteriort om STG och dra anteriorly att ta bort höljet från den dorsala sidan av STG.
| Förkortningar: | |
| STNS | Stomatogastric nervsystemet |
| STG | Stomatogastric ganglion |
| KUGGE | Commissural ganglion |
| STN | stomatogastric nerv |
| mvn | mediala ventrikulär nerv |
| ion | sämre matstrupen nerv |
| son | överlägsen matstrupen nerv |
| AGN | främre gastric nerv |
| DVN | dorsal ventrikulär nerv |
| LVN | laterala ventrikulär nerv |
| PSN | posterior magen nerv |
| vpln | ventrala bakre laterala nerv |
| pyn | pyloric nerv |
| PDN | pyloric dilator nerv |
Discussion
Anatomi hummer mage och STNS har blivit väl beskriven tidigare 5,6, och variationer av denna dissektion förfarande har använts i ett flertal studier. Vi rekommenderar att bli förtrogen med anatomin i magen 5-7 och STNS 5,8 före början dissektioner. Sådan kunskap kommer att minska risken för oavsiktliga skador på nerver och vävnad.
För att bibehålla hälsan av preparatet är det viktigt att behålla preparatet i en sval temperatur. Detta är lätt uppnås genom att byta ut saltlösning var 30 minuter med 4 ˚ C saltlösning förvaras i kylskåp. När nedsänkt i kall koksaltlösning, är den isolerade STNS förberedelse lönsamt i många timmar. Inspelningar i relaterade Homarus gammarus har visat stabil rytmisk aktivitet från STG hela 5 dagar för in vitro-9, liknande robusthet har setts i H. americanus (pers. obs.).
Begränsande bidrag till STG från commissural ganglierna krävs för att bevara den pågående motorn mönster. Därför, för att upprätthålla en normal rytmisk aktivitet dessa ganglier och jon, son och STN nerver måste hållas intakt. Den dissektion beskriver vi bevarar flera motoriska nerver (innehållande motorneuron axoner): den AGN s (innehållande Gastric Mill (GM) axoner), den mvn s (innehållande Lateral Gastric (LG) och sämre Cardiac (IC) axoner), den pyn s (innehållande pyloric neuron (PY) axoner), den PDN s (innehållande pyloric dilator (PD) axoner) och LVN s (innehållande Lateral pyloric (LP), Medial Gastric (MG), LPG axoner samt de från GM, PD och PY). Genom att dissekera ytterligare (eller annorlunda) nerver, kan andra motorneuron axoner spelas in. Varje enskild typ av motor neuron axon kan spelas in individuellt genom att dissekera och inspelning från nerven innervating muskeln till vilken typ av neuron projekt.
Detta preparat kan användas för en mängd olika studier fokuserade på nervsystemets funktion. Aktiviteten av nervceller får bokföras antingen med hjälp av intracellulära, vass elektrod inspelningar från somata eller axoner, eller genom att registrera elektriska impulser extracellularly från nerverna. Många jonkanaler i STG nervceller delvis har klonats och mRNA kan mätas manuellt dras somata 10,11.
Acknowledgments
Vi skulle vilja att erkänna våra rådgivare, Dr Eva Marder. Denna forskning stöds av National Institute of Health bidrag NS17813 för Eva Marder och NS059255 till AE T.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Fine Tungsten Wire (0.001 in. diameter) | Tool | California Fine Wire Company | Cut into 1-2mm pieces to use as fine pins. | |
| Forceps #5 | Tool | Fine Science Tools | 91150-20 | |
| Minuten Pins | Tool | Fine Science Tools | 26002-10 | |
| Moria Spring Scissors (7mm blades) | Tool | Fine Science Tools | 15370-52 | These are the top of the line. There are more economical spring scissors available from the same company. |
| Petri Dish (100x15mm) | Tool | Fisher Scientific | 08-757-12 | Fill 2-4mm with Sylgard 182. |
| Sylgard 182 | Other | Dow Corning | 182 | |
| Pin Holder | Tool | Fine Science Tools | 26018-17 | Optional. Desheathing can be done with scissors and fine forceps alone. |
| Super fine forceps #5SF | Tool | Fine Science Tools | 11252-00 | |
| Tungsten Needles | Tool | Fine Science Tools | 10130-05 | Optional. Desheathing can be done with scissors or with pins cut from fine tungsten wire. |
| Dissection microscope |
References
- Marder, E., Bucher, D. Central pattern generators and the control of rhythmic movements. Curr. Biol. 11, R986-R996 (2001).
- Nusbaum, M. P., Beenhakker, M. P. A small-systems approach to motor pattern generation. Nature. 417, 343-350 (2002).
- Clemens, S., Massabuau, J. C., Legeay, A., Meyrand, P., Simmers, J. In vivo modulation of interacting central pattern generators in lobster stomatogastric ganglion: influence of feeding and partial pressure of oxygen. J. Neurosci. 18, 2788-2799 (1998).
- Bierman, H. S., Tobin, A. E. Gross dissection of the stomach of the lobster, Homarus americanus. J Vis Exp. 27, (2009).
- Maynard, D. M., Dando, M. R. The structure of the stomatogastric neuromuscular system in Callinectes sapidus, Homarus americanus and Panulirus argus (Decapoda crustacean). Philos. Trans. R. Soc. Lond. B Biol. Sci. 268, 161-220 (1974).
- Herrick, F. H. Natural history of the American lobster. Bull. U.S. Bur. Fish. 29, 219-252 (1909).
- Marder, E., Bucher, D. Understanding circuit dynamics using the stomatogastric nervous system of lobsters and crabs. Annu. Rev. Physiol. 69, 291-316 (2007).
- Bucher, D., Taylor, A. L., Marder, E. Central pattern generating neurons simultaneously express fast and slow rhythmic activities in the stomatogastric ganglion. J. Neurophysiol. 95, 3617-3632 (2006).
- Mizrahi, A., Dickinson, P. S., Kloppenburg, P., Fénelon, V., Baro, D. J., Harris-Warrick, R. M., Meyrand, P., Simmers, J. Long-term maintenance of channel distribution in a central pattern generator neuron by neuromodulatory inputs revealed by decentralization in organ culture. J. Neurosci. 21, 7331-7339 (2001).
- Schulz, D. J., Goaillard, J. M., Marder, E. Variable channel expression in identified single and electrically coupled neurons in different animals. Nat. Neurosci. 9, 356-362 (2006).
- Schulz, D. J., Goaillard, J. M., Marder, E. E. Quantitative expression profiling of identified neurons reveals cell-specific constraints on highly variable levels of gene expression. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 13187-13191 (2007).
