Summary
HC11 lactogenic differentiering kan karakteriseras genom bildandet av välvda strukturer som kallas mammospheres. Strukturerna kan räknas upp faskontrast mikroskopi till stöd i kvantifiera lactogenic differentiering.
Abstract
En fenotypiska mått används ofta för att bestämma graden av lactogenic differentiering i mus bröst epitelceller kulturer är bildandet av kupolformade cellstrukturer kallas mammospheres
Protocol
- Den HC11 cellerna odlades till sammanflödet i 6 dagar i RPMI 1640 mediet kompletteras med 10% fetalt kalvserum, 5μg/ml Insulin, 10 mm HEPES, 10ng/ml epidermal tillväxtfaktor (EGF) för att upprätta kompetens.
- Cellerna tvättas med PBS och underhållas i tillväxt media utan fonden i 24 timmar.
- Att förmå lactogenic differentiering cellerna inkuberades i differentiering media, dvs RPMI med dexametason (10 -6 M), insulin (5 mikrogram / ml) och prolaktin (5 mikrogram / ml) kallas DIP.
- I angivna tider efter DIP Dessutom var mammospheres fotograferade och räknas upp faskontrast mikroskopi med en Olympus IX71 mikroskop med digitalkamera.
Representativa resultat:
Låg effekt förstoring av normala bröst epitelceller monolager och flera mammospheres samt hög effekt förstoring av en enda mammosphere visas i figur 1, respektive. 
Figur 1. Mammospheres. (A) Normalt bröst epitelceller monolager ska visas som en platt lager av sammanhängande celler. (B) Efter 3-5 dagar av DIP-stimulering flera mammospheres visas. Fotografi taget 5 dagar efter DIP-tillägg. (C) högre förstoring av ett enda fält som innehåller mammospheres på 5 dagar efter DIP-tillägg.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
För att denna teknik för att vara framgångsrika och av bästa kvalitet, måste epitelceller hållas på sammanflödet innan de framkallas med lactogenic hormoner. Det kan finnas situationer där det finns många mammospheres, vilket gör kvantifieringen svår. Således, för kvantitativ ändamål det är bäst att fotografera mammospheres vid en tidpunkt då antalet mammospheres kan räknas.
Även om det finns olika molekylära markörer används för att bestämma graden av lactogenic differentiering av bröst epitelceller, det finns några morfologiska markörer används för celler som odlas i 2D kultur. Förmågan hos epitelceller monolager att bilda miniatyr kupol strukturer där mjölkprotein kan samlas ger ett läge med vilket morfologiska förändringar som sker under denna utvecklingsprocess kan övervakas.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Medel från congressionally Regi Medical Research Fund bidrag (DAMD17-01-0264) till ML Cutler och USA militära Cancer Institute till ML Cutler stöttat arbetet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RPMI | Invitrogen | 21870076 | |
| Fetal Bovine Serum | Atlanta Biologicals | S11550 | |
| L-Glutamine | GIBCO, by Life Technologies | 25030 | |
| PenStrep | GIBCO, by Life Technologies | 15140 | |
| Hepes | Quality Biological, Inc. | 118089060 | |
| EGF | Sigma-Aldrich | E9644 | |
| Insulin | GIBCO, by Life Technologies | 12585-014 | |
| Dexamethasone | Sigma-Aldrich | D1756 | |
| Microscope | Olympus Corporation | IX71 | |
| Digital Camera | QImaging | Retiga 2000RV Fast 1394 |
References
- Blatchford, D. R., Hendry, K. A., Turner, M. D., Burgoyne, R. D., Wilde, C. J. Vectorial secretion by constitutive and regulated secretory pathways in mammary epithelial cells. Epithelial Cell Biol. 4, 8-16 (1995).
- Wang, W. Glucocorticoid induced expression of connective tissue growth factor contributes to lactogenic differentiation of mouse mammary epithelial cells. J Cell Physiol. 214, 38-46 (2008).
