Summary
Adrenal medular cromafins sistemas de cultura de células são extremamente úteis para o estudo da secreção de excitação de acoplamento em uma configuração em vitro. Este protocolo ilustra o método utilizado para dissecar as supra-renais e, em seguida, isolar a região medular, removendo o córtex adrenal. A digestão da medula em células cromafins único é então demonstrada.
Abstract
Adrenal medular cromafins sistemas de cultura de células são extremamente úteis para o estudo da secreção de excitação de acoplamento em uma configuração em vitro. Este protocolo ilustra o método utilizado para dissecar as supra-renais e, em seguida, isolar a região medular, removendo o córtex adrenal. A digestão da medula em células cromafins único é então demonstrada.
Protocol
Abreviaturas:
ACCs - Células Adrenal Cromafim, E. Soln - solução enzimática, E. DMEM - Modified Dulbecco Enriquecido Eagle Medium
- Preparação
- Adicionar papaína a quantidade desejada de E. Soln (40 unidades papaína / 1ml E. Soln.).
- Ativar papaína com carbogênio por cerca de 15 minutos em gelo. Buffer de Locke oxigenar sobre gelo também.
- Dissecação
- Use 10/08 rato semana.
- Antes de remover a digestão oxigenado tampão de Locke e colocar no gelo.
- Consulte o vídeo para procedimento de dissecção.
- Uma vez retirado, glândulas lugar em oxigenado tampão de Locke.
- Preparação de Gland
- Retire a gordura da glândula.
- Faixa de córtex da glândula.
- A digestão enzimática
- Filtro estéril oxigenado papaína.
- Fazer quatro piscinas de papaína oxigenada em uma placa de Petri.
- 3 piscinas deve ser de cerca 100uls.
- Uma das piscinas deve ser de cerca 400uls.
- Lavar medulas através piscinas
- 1 através da 3 piscinas 100ul.
- Em seguida, através da piscina 400ul
- Pippette 300ul E. Soln e medula peças de piscina 400ul em tubo de microcentrífuga.
- Qrap parafilme em microcentrífuga tubo e colocar em 37 ° C banho-maria por 20min.
- Lembre-se de continuar a oxigenar restantes E. Soln contendo papaína.
- Após 20 minutos estéril filtro mais E. Soln.
- Substituir as antigas E. medulas banho Soln com o recém-filtrada E. Soln.
- Triturações
- Aspirar e descartar E. Soln.
- Lavar medulas em 1ml E. DMEM.
- Aspirar e descartar E. DMEM.
- Adicionar 300ul E. DMEM e triturar 20X com 1ml ponta.
- Cortar ponta 200ul com lâmina de barbear estéril.
- Triturar 5-10X com ponta 200ul corte.
- Descartar E. DMEM medulas peças de banho. Medium irá conter detritos.
- Adicionar 300uls fresco E. DMEM para medulas peças.
- Triturar com a ponta 200ul 20x
- Pippette E. DMEM para microcentrífuga pedaços de tubo withough medulas. Médio conterá ACCs livres.
- Adicionar 300uls fresco E. DMEM para medulas peças.
- Triturar medulas com uma agulha de seringa 23,5 calibre 20x.
- Combine E. DMEM de ambas as triturações. Peças medulas não deve estar presente e deve agora ter uma aparência featherlike.
- Galvanização
- Microcentrífuga E. DMEM de as duas últimas etapas de trituração por 2,5 minutos a 3.7g s.
- Ressuspender sedimento em 50uls-200 E. DMEM, dependendo experimentos subseqüentes.
- Placa de 10 30uls em uma lamela de vidro.
- Esperar 15 minutos para que as células aderem.
- Adicionar 750uls de E. DMEM.
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