Summary
Traumatisk skada på ryggmärgen stör kommunikationen med hjärnan. För att återställa förlorad uppkoppling vi använder en perifer nerv graft för att ge ett underlag för regenerering fibrer i kombination med neurotrofa faktorer och matrix-modulerande enzymer för att ta bort hämmande molekyler för att främja långdistans tillväxt.
Abstract
Traumatisk skada på ryggmärgen (SCI) orsakar död av nervceller, störningar av motoriska och sensoriska nervfibrer (axon) vägar och avbrott i kommunikationen med hjärnan. Ett av målen med vår forskning är att främja Axon förnyelse för att återställa anslutningsmöjligheter över lesionen webbplatsen. För att åstadkomma detta har vi utvecklat en perifer nerv (PN) ympning teknik där delar av ischiasnerven antingen placeras direkt mellan den skadade ändarna av ryggmärgen eller används för att bilda en bro över lesionen. Det finns flera fördelar med detta tillvägagångssätt jämfört med transplantation av andra neurala vävnader regenererande axonerna kan riktas mot ett specifikt målområde är antalet och källa regenererande axoner lätt bestämmas genom att spåra metoder kan transplantat användas för elektrofysiologiska experiment för att mäta funktionell återhämtning i samband med axoner i transplantatet, och det är möjligt att använda en autolog nerv för att minska risken för avstötning. I vårt labb har vi utfört både autologa (som givare och mottagare är samma djur) och heterologa (givare och mottagare är olika djur) transplantat med jämförbara resultat. Denna metod har använts framgångsrikt i både akuta och kroniska skador situationer. Regenereras axoner som når distala änden av PN transplantat ofta misslyckas med att förlänga tillbaka in i ryggmärgen, så vi använder microinjections av chondroitinase att förnedra hämmande molekyler förknippade med ärrvävnad som omger området SCI. Samtidigt har vi funnit att erbjuda exogena tillväxt och molekyler trofiska uppmuntrar längre avstånd axonal återväxt i ryggmärgen. Flera månader efter transplantation vi utför en mängd olika anatomiska, beteendemässiga och elektrofysiologiska tester för att utvärdera återhämtning av funktion i vårt ryggmärgen skadade sladden djur. Denna experimentell metod har använts framgångsrikt i flera spinal modeller ryggmärgsskada, på olika nivåer av skador och i olika arter (mus, råtta och katt). Viktigt är perifer nerv ympning tillvägagångssätt effektiva för att främja förnyelse av akut och kroniskt skadade nervceller.
Protocol
1) Förberedelse för mikroskopisk operation
- Den kirurgiska stationen måste vara rena och desinficeras med en utspädd blekmedel lösning innan fastställer instrument och material tillbehör. Instrument kommer att autoklaveras 1 dag före operation och lagras i en steril behållare. Slå på Hot Bead Sterilizer (Fin Science Tools) som används för att avlägsna patogener och mikrobiella föroreningar från instrument mellan olika försök på olika djur.
- Anslut termisk barriär används för att hålla kroppstemperaturen under det kirurgiska ingreppet. Fastställs bomullspinnar och kuddar gasväv används för att kontrollera blödning. Förbered små (<2mm 3) stycken Gel Foam ska användas för mikro-hemostas och doppa i en steril koksaltlösning.
- Placera råttan i en induktionskammare och söva med isofluran (5% förångas i syre, flöde 2,0 l / min). Ta bort djur från kammarmusik till förberedelse bord och rakar ett brett område av päls från den avsedda kirurgiska området. Torka med 70% isopropylalkohol början i mitten av fältet och strålar ut, följt av skrubbning med Polyhydroxidine Solution (Xenodine) på samma sätt. Upprepa denna sekvens tvättar 3 gånger.
- Placera djur på termisk barriär, täcker näsa och mun med inandning kon, minska Isofluran till 3% och flödet till 0,2 l / min. Leverera lämplig dos av antibiotika (Ampicillin) genom subkutan injektion och smärtstillande (Buprenorfin 0,05 mg / kg) som intramuskulär injektion.
- Kirurgen kommer att skrubba händerna med Xenodine lösningen och skölj med vatten. En steril operationsrock kommer att monteras på kirurgen, händer kommer att torkas med en steril handduk och täckt med sterila handskar. Detta förfarande skall följas för varje kirurgiskt ingrepp som beskrivs i denna text.
- Locket täcker sterila instrument kommer att tas bort av en assistent och instrument kommer att läggas ut på ett sterilt täcker av kirurgen.
2) transection av PN för att främja degeneration
- Med djuret liggande på sidan gör en rak linje snitt från huvudet av lårbenet mot knä, hålla parallellt och cirka 3 mm från lårben. Skär igenom den ytliga biceps femoris muskler längs samma linje som huden snitt, för att avslöja den underliggande musculus vastus lateralis.
- Använda sax göra ett litet snitt i vastus lateralis nära knät och sträcker upp detta mot huvudet av lårbenet. Återigen med en sax försiktigt separera vastus lateralis tills förenade sken-och peroneusnerven grenar av ischiasnerven visualiseras (som löper parallellt med lårbenet).
- Trace dessa grenar mot huvudet av lårbenet tills huvudstammen av ischiasnerven identifieras. Precis nedanför bifurkation av ischiasnerven använda fin pincett att noga skilja bindväv (epineurium) som omger tibial nerven grenen (detta är den större gren).
- När isolerade slip en 6-0 silke ligatur runt tibia nerv och dra åt. Använd mikro sax för att transekt nerven rostralt om ligatur. Passera sutur linje genom musculus vastus lateralis och fästa i en knut. Detta kommer att ge en linje för enkel placering av avskurna ändan av tibia nerv när nerven ska skördas 7-10 dagar senare.
- Degeneration av tibial nerv innan ympning ger en miljö som är mer lämpade för axonal tillväxt än vad en ny nerv beredning.
- Stäng musculus vastus lateralis med 6-0 silke suturer. Stäng biceps femoris muskeln med 6-0 silke suturer. Stäng huden med Michel sår klipp. Stäng av flödet av isofluran, ta bort konen inandning näsan och placera djur i att hålla buren på termisk barriär och återvända till buren när den är alert och aktiv.
3) Borttagning av PN segment
- Bedöva djur, raka och rena den avsedda kirurgiska området enligt ovan (1,3). Placera djuret på termisk barriär.
- Ta bort sår klipp och separata tidigare hud snitt. Skär igenom sutur av ytliga muskler att avslöja vastus lateralis och skär genom sutur i denna muskel.
- Spåra sutur linjen avskurna ändan av tibia nerv och ta bort suturer från nerv. Använd fin pincett för att dissekera epineurium från en 15 mm längd tibialis nerv och skär genom denna distala änden. Ta bort nerven segmentet och sänk ned i sterilt Hanks Balanced Salt Solution.
- Om detta är en heterolog transplantat experiment euthanize de animaliska intraperitoneal injektion av Euthasol. Om detta är autologa transplantat experiment benet muskler och hud är stängd som beskrivs i 2,6) och djuret förberedda för cervikal ryggmärgsskada, som beskrivs nedan.
4) Cervical hemisection skada och transplantation
Dag 1
- Bedöva djur, raka och rena avsiktenDED kirurgiska området enligt ovan (1,3). Placera djuret på termisk barriär. Administrera antibiotika och smärtstillande medel som ovan (1,4).
- Leta reda på skallbenet skåran och framstående T2 rygg ryggrad process och gör ett snitt hela längden mellan dessa yttre landmärken. Skär genom mittlinjen på ytliga trapezius muskeln och separera den underliggande livmoderhalscancer rhomboideus muskler. Håll muskler isär genom att sätta in en spridare.
- Den djupa supraspinal muskler bör minskas från rygg ryggraden processerna C4, C5 och C6. Använda rongeurs utföra en partiell laminektomi C5 att exponera hela högra sidan och den mediala delen av vänster sida av ryggmärgen. Använd framstående dorsala venen som en milstolpe för ryggmärgen mittlinjen.
- Använd en mikro-skalpell blad eller 30 gauge nål och stick igenom dura mater och förlänga snittet över C5 ryggmärgen. Gör ett litet snitt i den underliggande subaraknoidal och Pia mater.
- Med en drog glas mikro-kanyl börja aspirera på rygg, höger sida av ryggmärgen, med lätt tryck och mikroföretag pincett för att separera vävnad och underlätta dess avlägsnande. Fortsätt genom mellanliggande och ventrala delar av ryggmärgen för att skapa en 2 mm lång hålighet som är komplett från rygg till ventrala och från mittlinjen till laterala hjärnhinnorna.
- Placera saltlösning har dränkts gel skum in i hålrummet för att uppnå hemostas.
- Ta bort den del av perifer nerv från Hanks lösningen. Dra försiktigt av epineurium från proximala 3mm av nerv segmentet och appose det slut på rostralt vägg hemisection lesionen hålighet. Säkra segmentet med 10-0 sutur genom epineurium till dura mater, då sutur dura stängt över den implanterade slutet av transplantat.
- Sandwich transplantatet mellan 2 st silastic membran (Biobrane) för skydd och lätt isolering vid ett senare tidpunkt. Plats vid sidan av C6, C7 och T1 vertebrala processer. Inte appose distala nerven slut på ryggmärgen eller muskelvävnad.
- Stäng muskler i lager med 4-0 sutur och nära huden snitt med sår klipp.
- Placera djuret att hålla buren på termisk barriär och återvända till buren när den är alert och aktiv.
Dag 21
- Bedöva djur, raka och rena den avsedda kirurgiska området enligt ovan (1,3). Placera djuret på termisk barriär och administrera antibiotika och smärtstillande medel som ovan (1,4). Skär igenom ytliga suturer för att exponera silastic membran som omger nerven transplantat. Försiktigt utan längden på nerven från silastic membranet med fin pincett och sax våren och speglar från kirurgiska området.
- Utföra en partiell laminektomi på höger sida av C7 vertebrala processen. Pierce hjärnhinnorna som ovan (4,4) och genom aspiration förbereda en 1 mm 3 rygg hålighet kvadranten lesion i C7 ryggmärgen. Använd saltlösning har dränkts gel skum för att uppnå hemostas och sedan ersätta med gel skum indränkt med chondroitinase ABC. Behandla lesion plats i 15 minuter, vilket ger färska chondroitinase-indränkt gel skum var 5 minuter.
- Täck yttre längd av nerv transplantat med Silastic membran. Stäng ytliga muskler med 4-0 suturer och huden snitt med sår klipp. Placera djuret att hålla buren på termisk barriär och återvända till buren när den är alert och aktiv.
Dag 23
- Bedöva djur, raka och rena den avsedda kirurgiska området enligt ovan (1,3). Placera djuret på termisk barriär och administrera antibiotika och smärtstillande medel som ovan (1,4). Skär igenom ytliga suturer för att exponera silastic membran som omger nerven transplantat. Stör ej transplantatet utan snarare utsätta C7 transplantat webbplats och använda en Hamilton spruta med drog glas kanyl till microinject 1μl av chondroitinase ABC i höger sida av ryggmärgen ca 1 mm distalt om rätten att sätta transplantat till ryggmärgen.
- Dra försiktigt av epineurium från distala 2mm av nerv segmentet och appose denna riktning för C7 lesionen hålighet. Säkra segmentet med 10-0 sutur genom epineurium till dura mater.
- Stäng ytliga muskler med 4-0 suturer och huden snitt med sår klipp. Placera djuret att hålla buren på termisk barriär och återvända till buren när den är alert och aktiv.
5) Elektrofysiologiska inspelning av aktionspotentialens i transplantat och distala ryggmärgen
- För att avgöra om elektrisk aktivitet överförs genom axoner som genereras i PNG måste vi först avslöja och isolera transplantat. Särskild försiktighet måste iakttas under den här proceduren för att undvika fysiskt skada transplantatet och det är där användningen av Silastic membran efter placeringen av transplantat är viktig. Bedöva djur, raka och rena den avsedda kirurgiska området enligt ovan (1,3). Ort: ee djur på termisk barriär.
- Efter öppnandet av huden och separera ytliga muskler är Silastic membran band identifieras och noggrant dissekerade fri från transplantatet.
- Använda rongeurs bort ryggfenan ryggraden processen omedelbart rostralt och caudal till PNG-spinal platser sladd apposition. Se till att inte störa transplantat för mycket under denna strategi. Gör ett snitt i dura mater på båda nivåerna.
- Cirka 1 cm rostralt om C5 graft-ryggmärgen apposition webbplats infoga en enstaka tråd (platina-iridium mix) att stimulera elektroden i ryggmärgen ipsilaterala till lesionen, till ett djup av cirka 1 mm. Lyft försiktigt i mitten delen av transplantat på en bipolär hooked elektrod. Ge enda stimulerande pulser av 10μA med 100μsec varaktighet och avgöra om det finns aktionspotentialer reser genom axoner som regenereras i transplantat.
- Växla anslutningar och placering av kablar så att fast elektroden blir stimulerande elektrod och den gemensamma tråden sätts in i ryggmärgen distalt om rätten att sätta PNG till ryggmärgen och försöker spela in aktionspotentialer i ryggmärgen.
- I slutet av försöket ger ett tåg av 1mA stimuli för 100μsec tid vid 50Hz, för totalt 1 timme. Euthanize djur 1 timme senare, BEGJUTA med 4% paraformaldehyd och bearbeta ryggmärgsvävnad för immuncytokemiska upptäckt av ekonomichefer i de nervceller som aktiveras av regenereras axoner i PNG.
6) Retrograd märkning av nervceller som återskapar axoner i PNG och anterograd märkning av axoner som återskapar tillbaka in i ryggmärgen
- För djur som inte testats av elektrofysiologiska åtgärder är det möjligt att identifiera källan till axoner som växer in i transplantat och under deras uppsägning i ryggmärgen. Bedöva djur, raka och rena den avsedda kirurgiska området enligt ovan (1,3). Placera djuret på termisk barriär och exponera PNG som beskrivs i 6.1 ovan.
- Använd mikro sax för att klippa igenom transplantat efter halva punkt och band tillbaka epineurium från den skurna ändarna av transplantat. Reflektera den skurna ändarna bort från varandra och lägger varje på ett separat ark parafilm.
- Placera en KOMPRESS gel skum indränkta med True Blue på den proximala avskurna ändan för att märka nervceller som bidrog ett axon till PNG. Placera en KOMPRESS gel skum indränkt i biotinylerad dextran amin (BDA) i distala avskurna ändan för att märka axoner som sträcker sig från transplantat tillbaka in i ryggmärgen.
- Euthanize djur 3-4d senare BEGJUTA med 4% paraformaldehyd och bearbetar hjärnan och ryggmärgen sektioner vävnad för lysrör mikroskopi för True märkta Blå nervceller eller för BDA histokemi på märkta axoner.
7) Thoracic komplett transection skada och transplantation
Detta ger ett alternativ till den cervikala hemisection skada modellen ovan. Här en mer allvarlig, bilaterala skador produceras och delar av perifera nerver placeras in i lesionen hålrum till spännvidd och rostralt och caudal stubbar av de skadade ryggmärgen.
Dag 1
- Bedöva djur, raka och rena den avsedda kirurgiska området enligt ovan (1,3). Placera djuret på termisk barriär. Administrera antibiotika och smärtstillande medel som ovan (1,4).
- Identifiera T12 vertebrala nivå vid punkt införandet av revbenet. Gör huden snitt från denna punkt rostralt över ryggraden processer T11, T10 och T9. Skär igenom ytlig fascia genom supraspinal muskler knutna till dessa tre processer.
- Utför komplett laminektomi av T10 vertebrala process (överliggande T12 ryggmärgen segment). Använd en mikro-skalpell blad eller 30 gauge nål och stick igenom dura mater och förlänga snittet över T12 ryggmärgen. Gör ett litet snitt i den underliggande subaraknoidal och Pia mater.
- Med en drog glas mikro-kanyl börja aspirera på T12 ryggmärgen bilateralt, med lätt tryck och mikroföretag pincett för att separera vävnad och underlätta dess avlägsnande. Fortsätt genom mellanliggande och ventrala delar av ryggmärgen för att skapa en 3 mm lång hålighet som är komplett rygg till ventrala och mellan de laterala hjärnhinnorna.
- Använd saltlösning har dränkts gel skum för att uppnå hemostas och sedan ersätta med gel skum indränkt med chondroitinase ABC. Behandla lesion plats i 15 minuter, vilket ger färska chondroitinase-indränkt gel skum var 5 minuter.
- Ta bort den del av perifer nerv från Hank är lösningen. Försiktigt återspeglar epineurium från proximala 4mm av nerv-segmentet och skär en längd ligger an passa mellan rostralt och caudal stubbar på ena sidan av ryggmärgen. Placera en andra segmentet tillsammans med de ympade första segmentet, apposed till andra sidan i ryggmärgen. Sutur duran stängt över den implanterade transplantat och täck dura med en litenbit silastic membran.
- Stäng muskler i lager med 4-0 sutur och nära huden snitt med sår klipp.
- Placera djuret att hålla buren på termisk barriär och återvända till buren när den är alert och aktiv.
Dag 3
- Bedöva djur, raka och rena den avsedda kirurgiska området enligt ovan (1,3). Placera djuret på termisk barriär och administrera antibiotika och smärtstillande medel som ovan (1,4). Skär igenom ytliga suturer för att exponera silastic membran överliggande transplantatet sajten. Stör ej transplantatet utan snarare utsätta ryggmärgen caudal till transplantatet och använda en Hamilton spruta med drog glas kanyl till microinject 1μl av chondroitinase ABC i varje sida av ryggmärgen ca 1 mm distalt om rätten att sätta transplantat till ryggmärgen.
- Stäng ytliga muskler med 4-0 suturer och huden snitt med sår klipp. Placera djuret att hålla buren på termisk barriär och återvända till buren när den är alert och aktiv. Utför elektrofysiologiska stimulans och inspelning och spårämne märkning som beskrivs i 5) och 6) ovan.
8) representativa resultat
När detta förfarande är optimerat perifer nerv segmentet kommer noggrant att integreras med värd ryggmärgen. Stigande och fallande spinal axoner kommer in i transplantatet, växer i en relativt rak linje parallellt med längden på transplantat och sträcker sig till den distala änden av transplantat med en hastighet av ca 1 mm per dag. Vid ankomsten till den distala änden, kommer axoner tränga in i angränsande ryggmärgen om chondroitinase har använts för att ta bort hämmande proteoglykaner från den omgivande ärrvävnad. Funktionell anslutning kommer att fastställas av elektrofysiologiska och immuncytokemiska upptäckt av en reaktion från ryggmärgen nervceller till stimulering av axoner i transplantat. Anatomiska korrelation för funktionell återhämtning kommer att bedömas genom att spåra antalet och längden av axoner som har förlängas utöver den nerv transplantat tillbaka in i ryggmärgen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
- För reproducerbarhet av experimentet är det viktigt att nivån på ryggmärgsskada vara konsekvent från djur till djur. Därför är det viktigt att den lämpliga ryggraden processen för laminektomi identifieras. Eftersom vi använder en hemisection eller transection lesion modell för denna studie finns det ingen tvetydighet om storleken på den skada eller om vissa spinal kontrakt skadades eller skonas.
- Det är nödvändigt att perifera nerver i förväg urartade före transplantation, eftersom det initierar nedbrytning av perifera axoner att ge plats för regenerering axoner att växa och eftersom det aktiverar Schwann celler att producera flera neurotrofa faktorer som stöd för inväxt av axoner.
- Initial placering av skär ändarna av transplantat till ryggmärg bör göras ordentligt (utan att skada graft) för att optimera axon tillväxt till och från transplantatet. Direkt rätten att sätta perifer nerv transplantat till ryggmärgen och säkra transplantat med suturer är kritisk.
- Användning av chondroitinase att ändra den extracellulära matrisen runt transplantat platsen är en annan viktig funktion i detta experiment. Gliaceller ärrvävnad bildas som svar på ryggmärgsskada är ett strukturellt och kemiskt hinder för axonal tillväxt. Chondroitinase nedbrytning av hämmande proteoglycan innehållet i ärret underlättar utbyggnaden av regenererande axoner till och bortom transplantat.
- Det finns flera områden för eventuell ändring av detta förfarande för att förbättra graden av axonal tillväxt till och från de perifera nerv transplantat. Vi experimenterar med leverans av neurotropa faktorer till platsen för apposition mellan transplantat och värd ryggmärgen att främja regenerativ svar av skadade axoner. En ökning av neurotropa faktorer kan uppnås genom injektion av virala vektorer för att öka den lokala produktionen eller genom injektion av nanopartiklar för en gradvis frisättning av faktorer. Vi undersöker betydelsen av motion för att främja produktion av endogena neurotropa faktorer för att underlätta axonal tillväxt. Förutom de modeller aspiration lesionen som beskrivs ovan har vi utvecklat en cervikal modell kontusion skada och har framgångsrikt tillämpats vårt perifera förhållningssätt nerv graft för att stödja axonal regeneration.
- För alla våra studier vi anställer flera testmetoder för att mäta förändringar i motoriska och sensoriska funktioner efter ryggmärgsskada och efter intraspinal ympning av perifera nerver.
Betydelse:
Med perifer nerv ympning strategi som beskrivs ovan har vi visat att vuxna motoriska och sensoriska nervceller kommer att förnya sina skadade axonal process för långa sträckor när den förses med ett lämpligt substrat för tillväxt. Vi har visat att detta tillvägagångssätt kan utföras som en akut eller fördröjd behandling strategi och att den kan tillämpas framgångsrikt litet (mus, råtta) och stora (katt) försöksdjur. Det är viktigt att den funktionella aktiviteten av regenererande axoner testas och perifera nerver transplantat modellen ger relativt lätt tillgång till alla de axoner överbrygga en ryggmärgen lesion. Detta är en uppenbar fördel jämfört med andra transplantation närmar sig.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av NIH / NINDS Bidrag NS26380 och NS55976, den Christopher och Dana Reeve Foundation och Daniel Heumann fonden för ryggmärg forskning. Den Drexel University College of Medicine Spinal Cord Research Center ger stöd för Core Facilities användas för att slutföra detta arbete.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10-0 silk suture | ArosSurgical | T5A10N10 | |
| 6-0 silk suture | McKesson | 2693 | |
| Ampicillin | McKesson | 483549 | |
| Antibody to cFos | Sigma-Aldrich | F7799 | |
| Biotinylated dextran Amine | Invitrogen | D7135 | |
| Buprenorphin (.3mg/ml) | McKesson | 12496075701 | |
| Chondroitinase ABC | Associates of Cape Cod | 100332-1A | |
| Euthasol | Webster Veterinary | 07-805-9296 | |
| Hanks Balanced Salt Solution | Cellgro | 21-021-CV | |
| Isoflurane | Henry Schein | 209-1966 | |
| Michel Wound Clips | Fine Science Tools | 12040-02 | |
| Neurotrace Kit | Invitrogen | N7167 | |
| True Blue | Sigma-Aldrich | T5891 | |
| Xenodine | Webster Veterinary | 92201 | |
| Hot Bead Sterilizer | Fine Science Tools | ||
| Forced Exercise Wheel | Lafayette Instruments | ||
| TreadScan System | Clever System | ||
| Infinite Horizon Impact Device | Precision Systems and Instrumentation | ||
| Magnetic Stimulation Device | Magstim |
References
- Houle, J. D. Demonstration of the potential for chronically injured neurons to regenerate axons into intraspinal peripheral nerve grafts. Exp. Neurol. 113, 1-9 (1991).
- Ye, J. H., Houle, J. D. Treatment of the chronically injured spinal cord with neurotrophic factors can promote axonal regeneration from supraspinal neurons. Exp. Neurol. 143, 70-81 (1997).
- Houle, J. D., Tom, V., Mayes, D., Wagoner, G., Phillips, N., Silver, J. Combining an autologous peripheral nerve bridge and matrix modification by chondroitinase allows robust functional regeneration across a hemisection lesion of the adult rat spinal cord. J. Neurosci. 26, 7405-7415 (2006).
- Tom, V., Houle, J. D. Intraspinal microinjection of chondroitinase ABC following injury promotes axonal regeneration out of a peripheral nerve graft. Exp. Neurol. 211, 315-319 (2008).
